Визначення чутливості представників сімейства Enterobacteriaceae

1. Оцінка антібіотікочувствітельності Enterobacteriaceae - збудників некишкових інфекцій
2. Характеристика препаратів першого ряду
3. Характеристика додаткових препаратів
4. Тестування Enterobacteriaceae - збудників кишкових інфекцій
5. Тестування Enterobacteriaceae - збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІМП)
6. Виявлення БЛРС у штамів Enterobacteriaceae фенотипическими методами
7. Тести, які підтверджують продукцію БЛРС
8. постановка тесту
9. інтерпретація результатів
10. Контроль якості
11. постановка тесту
12. інтерпретація результатів
13. Контроль якості
14. постановка тесту
15. інтерпретація результатів
16. контроль якості

Представники сімейства Enterobacteriaceae є одними з провідних етіологічних агентів як позалікарняних, так і нозокоміальних інфекцій, для них характерно крайнє різноманітність можливих механізмів резистентності до АБП.

При тестуванні мікроорганізмів сімейства Enterobacteriaceae рекомендується використовувати окремі набори АБП для визначення чутливості:

• збудників некишкових інфекцій (крім інфекцій сечовивідних шляхів);
• збудників кишкових інфекцій (Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp.);
• збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІМП).

Необхідність такого розподілу пов'язана з особливостями фармакокінетики окремих АБП в шлунково-кишковому тракті і сечовивідних шляхах, а також відмінностями в їх клінічній ефективності.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості для штамів Enterobacteriaceae (граничні значення МІК АБП і відповідні діаметри зон пригнічення росту) наведені в таблиці 6 .

Оцінка антібіотікочувствітельності Enterobacteriaceae - збудників некишкових інфекцій

Основу лікування позакишкових інфекцій, викликаних представниками родини Enterobacteriaceae, складають бета-лактамні антибіотики. Вибір препаратів для включення в дослідження чутливості, а також принципи інтерпретації результатів ґрунтуються на даних про природну активності антибіотиків. Незважаючи на наявність природного активності відносно деяких представників Enterobacteriaceae такі препарати, як незахищені аміно-, карбокси- і уреїдопеніциліни, а також цефалоспорини I покоління практично повністю втратили значення при лікуванні інфекцій, що викликаються цими бактеріями, в зв'язку з цим оцінка чутливості до них позбавлена ​​практичного сенсу .

Препаратами альтернативними бета-лактамів є аміноглікозиди і фторхінолони.

Оцінювати чутливість збудників некишкових інфекцій до тетрацикліну, хлорамфеніколу і ко-тримоксазолу в даний час недоцільно. Препарати відносяться до бактеріостатиків і істотно поступаються за ефективністю антибіотикам інших груп, крім цього серед мікроорганізмів до них широко поширена резистентність. Перелік препаратів, пропонованих для тестування по відношенню до представників сімейства Enterobacteriaceae наведено в табл. 7 .

Характеристика препаратів першого ряду

В першу чергу чутливість представників сімейства Enterobacteriaceae необхідно оцінювати до наступних препаратів.

• Ампіцилін. Є типовим представником підгрупи амінопеніцилінів. Отримувані результати можна повністю екстраполювати на амоксицилін. Оцінювати чутливість до амоксициліну недоцільно, оскільки критерії чутливості до цього антибіотика для Enterobacteriaceae не обгрунтовані. Включення ампіциліну в набір для тестування Enterobacteriaceae пояснюється не стільки клінічним значенням цього антибіотика, скільки важливістю для оцінки фенотипу досліджуваного мікроорганізму і внутрішнього контролю якості.
• Інгібіторзащіщенние амінопеніцилін. Амоксицилін / клавуланат і ампіцилін / сульбактам багато в чому схожі за своїми антибактеріальними властивостями. У той же час необхідно мати на увазі, що клавуланат є ефективнішим інгібітором бета-лактамаз. Можливі окремі випадки збереження чутливості до амоксициліну / клавуланату при стійкості до ампіциліну / сульбактаму.
• Цефотаксим або цефтриаксон. Обидва цефалоспорина практично ідентичні за своїми антибактеріальними властивостями. Результати оцінки чутливості до вказаних антибіотиків необхідно оцінювати з огляду на можливу продукцію мікроорганізмами БЛРС. При підтвердженні продукції БЛРС всі цефалоспорини необхідно розглядати як клінічно недостатньо ефективні незалежно від конкретних результатів тестування.
• Цефтазидим. Антибіотик не рекомендується для лікування інфекцій, що викликаються Enterobacteriaceae. Однак оскільки цефтазидим високо чутливий до дії більшості БЛРС, то він може служити маркером продукції цих ферментів досліджуваним мікроорганізмом.
• Гентаміцин. Результати, одержані при оцінці чутливості до гентаміцину, не можна екстраполювати на інші аміноглікозиди.
• Фторхінолон. Стосовно до Enterobacteriaceae істотних відмінностей в рівні антибактеріальної активності між ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, а також новими "антипневмококовими" фторхинолонами немає. Між перерахованими препаратами спостерігають практично повну перехресну резистентність. Вибір конкретного фторхінолону для включення в дослідження повинен грунтуватися на місцевих умовах.

Характеристика додаткових препаратів

Включення в набір для дослідження додаткових антибіотиків визначається особливістю ЛПУ.

У разі важких, вкрай важких і, особливо, госпітальних інфекцій, в дослідження доцільно включати наступні антибіотики.

• Карбапенеми. Оскільки стійкість до цих антибіотиків серед Enterobacteriaceae зустрічається дуже рідко і, як правило, носить перехресний характер між окремими представниками групи, то в дослідження досить включати лише один препарат.
• Цефепім. Антибіотик має значно більшу стійкістю до хромосомних бета-лактамаз класу С у порівнянні з цефалоспоринами III покоління, може також зберігати активність відносно частини продуцентів БЛРС.
• Цефоперазон / сульбактам, тикарцилін / клавуланат. Препарати можуть зберігати активність in vitro щодо частини продуцентів БЛРС. Однак клінічне значення цього феномену не визначене. Дані, що підтверджують наявність або відсутність клінічної ефективності вказаних АБП при інфекціях, що викликаються продуцентами БЛРС, відсутні.
• Цефокситин. Антибіотик не має реального значення в лікуванні інфекцій, викликаних Enterobacteriaceae, проте може бути використаний для діффереціровкі продуцентів БЛРС і АmрС. Продуценти БЛРС - чутливі, продуценти АmрС - стійкі.
• Амікацин. До амікацину зберігає чутливість значна частина штамів, стійких до гентаміцину. Оцінювати чутливість Enterobacteriaceae до інших аміноглікозидів недоцільно.

Для оцінки чутливості збудників інфекцій легкого та середнього ступенів тяжкості в дослідження слід включати:

• цефалоспорини II покоління і оральні цефалоспорини II - III поколінь.

При визначенні чутливості мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae особливо важливим є виявлення штамів, що виробляють бета-лактамази розширеного спектру (БЛРС). Необхідність додаткової детекції даного механізму стійкості пов'язана з тим фактом, що частина продуцентів БЛРС при застосуванні існуючих критеріїв потрапляють в категорію чутливих, однак клінічні спостереження свідчать про недостатню ефективність цефалоспоринів II - IV при інфекціях, що викликаються такими мікроорганізмами. Для детекції БЛРС пропонується послідовне проведення скринінгу (виявлення підозрілих штамів) і підтверджуючих тестів відносно підозрілих штамів. Для ефективного скринінгу в рутинне мікробіологічне дослідження необхідно включати декілька цефалоспоринових антибіотиків, мінімальний набір повинен включати 3 цефалоспорина III покоління - цефотаксим, цефтриаксон і цефтазидим.

Методи скринінгу БЛРС і підтверджуючі тести наведені нижче.

• У разі виявлення або підозри на продукцію БЛРС необхідно інформувати лікарів про високу ймовірність клінічної неефективності терапії пеніцилінами і цефалоспоринами I - IV поколінь, незалежно від конкретних результатів визначення чутливості.

При видачі результатів тестування мікроорганізмів групи Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, Providencia необхідно вказувати, що при монотерапії генералізованих інфекцій, викликаних даними збудниками, цефалоспоринами III покоління, можливий розвиток резистентності в процесі лікування.

При інтерпретації результатів оцінки стійкості до аміноглікозидів слід орієнтуватися на такі особливості. Широкий субстратної профіль аміноглікозідмодіфіцірующіх ферментів, можливість продукції мікроорганізмами сімейства Enterobacteriacae одночасно декількох ензимів зумовлюють частий перехресної резистентності між окремими препаратами. На підставі даних про чутливість або стійкості досліджуваного мікроорганізму до однієї або кількох аминогликозидам прогнозувати рівень резистентності до інших антибіотиків цієї групи практично неможливо.

Інтерпретація результатів оцінки резистентності до хінолонів, як правило, не викликає труднощі. Штами, стійкі до нефторірованним хінолонів, можуть зберігати чутливість до фторованим. Значна частина штамів, стійких до нефторірованним хінолонів, зберігає чутливість до фторхінолонів. На практиці можна вважати, що між ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином і ломефлоксацином є повна перехресна резистентність. Сучасні антіпневмококковие фторхінолони (левофлоксацин, спарфлоксацин і моксифлоксацин) не мають переваг перед перерахованими препаратами і характеризуються перехресної резистентністю.

Тестування Enterobacteriaceae - збудників кишкових інфекцій

Основну роль в етіології кишкових інфекцій грають представники пологів Shigella, Salmonella, Escherichia і Yersinia, що відносяться до сімейства Enterobacteriaceae, а також родин Spirillaceae (рід Campylobacter) і Vibrionaceae. У рутинній практиці при кишкових інфекціях визначення чутливості слід проводити тільки для штамів сімейства Enterobacteriaceae.

Перелік АБП, що підлягають дослідженню, вельми обмежений і включає препарати з підтвердженою клінічною ефективністю ( таблиця 8 ). При генералізованих інфекціях, викликаних мікроорганізмами роду Salmonella (виділення збудника із стерильних локусів), в дослідження необхідно включати цефалоспорини III покоління (цефотаксим або цефтріаксон).

Додатково можливе включення хлорамфеніколу і тетрацикліну, однак їх роль в лікуванні інфекцій шлунково-кишкового тракту представляється на сьогоднішній день вкрай сумнівною. У той же час результати визначення чутливості до цих АБП можуть мати певне значення для епідеміологічного моніторингу.

Тестування Enterobacteriaceae - збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІМП)

З практичної точки зору ІМП вкрай важливо розділяти на позалікарняних і нозокоміальних. Для тестування штамів Enterobacteriaceae, виділених при нозокоміальних ІМП, слід використовувати той же перелік АБП, що і для визначення чутливості збудників інфекцій різної локалізації.

Формування окремого набору антибактеріальних препаратів для оцінки чутливості збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів доцільно при наявності значного потоку таких досліджень. Приблизний перелік препаратів наведено в таблиці 9 .

Виявлення БЛРС у штамів Enterobacteriaceae фенотипическими методами

Обгрунтовані рекомендації щодо виявлення БЛРС фенотипическими методами поширюються тільки на штами Klebsiella spp. і E.coli. Однак продукція БЛРС може відзначатися практично у всіх видів сімейства Enterobacteriaceae і ряду інших грамнегативних мікроорганізмів. З огляду на поширеність ферментів цієї групи, за доцільне проведення скринінгу всіх виділених в лабораторії штамів Enterobacteriaceae з подальшим використанням спеціальних підтверджуючих досліджень у будь-яких штамів, які за даними попереднього тестування проявляють знижену чутливість хоча б до одного з цефалоспоринів III покоління (МПК ≥ 2 мг / л або еквівалентну зменшення діаметра зони пригнічення росту - табл. 10 ).

Скринінг не припускав проведення спеціального дослідження, його основу має становити аналіз даних, отриманих в рутинній практиці. У той же час для ефективного скринінгу в рутинне мікробіологічне дослідження необхідно включати декілька цефалоспоринових антибіотиків, навіть якщо використання деяких з них в якості терапевтичних препаратів не планується. Найбільш чутливими до гідролізу БЛРС вважаються цефподоксим і цефтазидим. Відповідно, ці препарати доцільно включати в набір для визначення чутливості Enterobacteriaceae. При відсутності можливості тестування цефподоксима, мінімальний набір цефалоспоринів III покоління, які використовуються для визначення чутливості грамнегативних мікроорганізмів, повинен включати цефотаксим, цефтриаксон і цефтазидим.

• Чим більше цефалоспоринів використано для тестування, тим більш достовірними будуть результати виявлення БЛРС. Деякі штами можуть проявляти високий рівень стійкості до всіх АБП, у інших же виявляється лише незначне підвищення МПК до 1 - 2 АБП цефалоспоринового ряду. Результати тестування Klebsiella spp. і E. coli до цефалоспоринів, що вказують на можливу продукцію БЛРС цими штамами, наведені в таблиці 10 .
• Після виявлення штаму, підозрілого на продукцію БЛРС, рекомендується провести підтверджуючий тест.

Тести, які підтверджують продукцію БЛРС

Всі фенотипічні тести для підтвердження продукції БЛРС є варіантами стандартних методів визначення чутливості до АБП і засновані на ингибиции БЛРС клавуланатом. При постановці цих тестів проводиться порівняння чутливості досліджуваних мікроорганізмів до різних цефалоспоринів III покоління і до комбінації цих антибіотиків з клавулановою кислотою.

Диско-дифузійний метод передбачає використання стандартних дисків зі звичайним вмістом цефотаксиму і цефтазидиму (30 мкг) або диска з цефподоксимом (10 мкг), а також диски, що містять комбінації: цефотаксим + клавуланат, або цефтазидим + клавуланат (30/10 мкг), або цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В дослідження доцільно включати одночасно і диски з цефотаксимом, і диски з цефтазидимом, і їх комбінаціями з клавуланатом.

постановка тесту

Методика приготування мікробної суспензії і інокуляції чашок з агаром стандартні. На поверхню агару накладають диски з цефалоспоринами і їх комбінаціями з клавулановою кислотою. Чашки інкубують в термостаті при 35 ° С протягом 18 - 20 годин.

інтерпретація результатів

Різниця в діаметрах зон пригнічення росту для дисків з цефподоксимом / клавулановою кислотою і цефподоксимом на 6 мм і більше або дисків з цефотаксимом / клавулановою кислотою і цефотаксимом, цефтазидимом / клавулановою кислотою і цефтазидимом на 5 мм і більше свідчить про продукцію штамом БЛРС. Необхідно підкреслити, що результат вважається позитивним, якщо вказані відмінності отримані хоча б для однієї пари дисків.

Контроль якості

Для контролю якості дослідження необхідно використовувати 2 штаму (негативний і позитивний контролі):

• Негативний контроль. При тестуванні контрольного штаму E.coli АТСС 25922, що не продукує β-лактамаз, відмінності в діаметрах зон між дисками з інгібітором і без нього не повинні перевищувати 2,0 мм.
• Позитивний контроль. При тестуванні контрольного штаму K.pneumoniae АТСС 700603, продукує БЛРС, відмінності в діаметрах зон між дисками з цефподоксимом / клавулановою кислотою і цефподоксимом ≥ 6 мм, з цефотаксимом / клавулановою кислотою і цефотаксимом> 3 мм, з цефтазидимом / клавулановою кислотою і цефтазидимом ≥ 5 мм.

Метод серійних розведень в бульйоні передбачає використання подвійних серійних розведень препаратів в наступних діапазонах концентрацій: цефтазидиму від 0,25 мг / л до 128,0 мг / л; цефтазидима / клавуланату від 0,25 / 4,0 мг / л до 128,0 / 4,0 мг / л; цефотаксима від 0,25 мг / л до 64,0 мг / л; цефотаксима / клавуланату від 0,25 / 4,0 мг / л до 64,0 / 4,0 мг / л. В дослідження доцільно включати обидва цефалоспорини і їх комбінації з клавулановою кислотою.

постановка тесту

Методика виконання дослідження (приготування розведень антибіотиків в бульйоні, мікробної суспензії, інокуляція і інкубація) - стандартна.

інтерпретація результатів

Зниження МПК цефтазидима або цефотаксиму не менше ніж в 8 разів (на 3 послідовних дворазових розведення) в присутності інгібітора, в порівнянні зі значеннями МПК відповідних цефалоспоринів без інгібіторів, свідчить про продукцію штамом БЛРС.

Контроль якості

• Негативний контроль. При тестуванні контрольного штаму E.coli АТСС 25922, що не продукує β-лактамаз, співвідношення МПК відповідних цефалоспоринів III покоління до МПК їх комбінації з клавуланатом повинні бути <8.
• Позитивний контроль. Для штаму K.pneumoniae АТСС 700603, продукує БЛРС, співвідношення значень МПК цефалоспоринів і МПК їх комбінацій з клавуланатом повинні бути ≥ 8.

Метод подвійних дисків (double-disk test)

Хоча цей метод і не відноситься до добре стандартизованим, чутливість, специфічність і простота виконання дозволяють розглядати його прийнятним методом для рутинної практики. Метод передбачає використання доступних комерційних дисків з цефалоспоринами III покоління і з амоксициліном / клавуланату.

Метод "подвійних дисків" представляє собою варіант класичного ДДМ визначення чутливості, який дозволяє виявити продукцію БЛРС за наявністю розширеної зони пригнічення росту навколо диска з будь-яким цефалоспорином III покоління напроти диска, що містить клавуланова кислота (синергізм відзначається в ділянці перетину зон дифузії двох дисків, розташованих на невеликій відстані один від одного).

постановка тесту

Методика приготування мікробної суспензії, інокуляції і інкубації чашок не має відмінностей від стандартного ДДМ. Особливістю методу є те, що через 5 - 10 хв. після інокуляції на поверхню агару накладають диски з АБПі: в центр - диск, що містить клавуланова кислота, зазвичай у вигляді комбінації амоксицилін / клавуланат (20/10 мкг), з боків від нього на відстані 20 і 30 мм між центрами дисків - диски з цефтазидимом (30 мкг) і цефотаксиму (30 мкг). Використання двох дисків кожного АБП, розташованих на різній відстані від диска з клавулановою кислотою, дозволяє підвищити ефективність виявлення БЛРС.

інтерпретація результатів

Якщо тестований мікроорганізм виробляє БЛРС (дія яких в більшості випадків можна зупинити клавуланатом), зона пригнічення росту навколо диска з цефалоспорином III покоління виявиться "витягнутої" в сторону диска з амоксициліном / клавуланату (рис. 2). Причиною даного ефекту є додаткове пригнічення росту мікроорганізму в тій зоні, куди дифундують і клавуланат, і цефалоспорин III покоління. Тест суто якісний і вимагає певних навичок при інтерпретації.

Мал. 2. Виявлення продукції БЛРС за допомогою методу "подвійних дисків". Негативні результати: a) E.coli (БЛРС-), b) E.cloacae (гіперпродукція AmpC). Позитивні результати: c), d) K.pneumoniae (БЛРС +). Позначення дисків: AMC - амоксицилін / клавуланова кислота (20/10 мкг), CAZ - цефтазидим (30 мкг), CTX - цефотаксим (30 мкг), CPO - цефпиром (30 мкг).

контроль якості

Паралельно з аналізом досліджуваних культур тестують контрольні штами.

На жаль, жоден з традиційних мікробіологічних методів, заснованих на оцінці фенотипу мікроорганізму, не забезпечує виявлення БЛРС в 100% випадків. Ситуація істотно ускладнюється при наявності у мікроорганізмів декількох детермінант стійкості одночасно, що зустрічається досить часто. Наприклад, при продукції БЛРС і гіперпродукції хромосомних бета-лактамаз класу С стійкість останніх до клавуланату маскує присутність БЛРС.

назад