ХАРАКТЕР ЕКСПРЕСІЇ C-FOS нейронів МЕДІАЛЬНОЇ префронтальної кори В УМОВАХ КОМБІНОВАНОГО стресу І ВПЛИВУ ТЕС-ТЕРАПІЇ

1. бібліографічна посилання

1 Каде А.Х. 1 Поляков П.П. 1 Ліпатова А.С. 1 Сотниченко А.С. 1 Куєвда Є.В. 1 Губарєва Е.А. 1

1 ФГБОУ ВО «Кубанський державний медичний університет» МОЗ Росії

У даній роботі вивчалася стрес-індукована гіперактивація нейронів медіальної префронтальної кори щурів і можливість її корекції транскраніальної електростимуляцією (ТЕС-терапією). ТЕС-терапія надає системне сприятливу дію на нейроіммуноендокрінную регуляцію, пов'язане з посиленням синтезу і секреції β-ендорфіну і модуляцією роботи серотонінергічного, дофамінергічних та холінергічного механізмів. В якості маркера активації клітин використовувалася оцінка експресії гена c-fos імуногістохімічним методом. Індивідуальна стресостійкість оцінювалася за допомогою модифікованого тесту вимушеного плавання. В якості моделі комбінованого стресу використовувалися модифікований тест вимушеного плавання і ортостатический стрес. Результати цього дослідження вказують на те, що транскраніальна електростимуляція зменшує вираженість гіперактивації різних регіонів медіальної префронтальної кори при стресі, і співвідносяться з даними попередніх робіт.

медійна префронтальна кора

c-fos

ортостатический стрес

тест вимушеного плавання

ТЕС-терапія

1. Вплив ТЕС-терапії на характер стрес-індукованої експресії c-fos нейронами паравентрикулярного ядра гіпоталамуса / Поляков П.П. [И др.] // Уральський медичний журнал. - 2017. - № 5. - C. 121-126.

2. Модифікація методики ТЕС-терапії для її застосування у дрібних лабораторних гризунів / Ліпатова А.С. [И др.] // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 5 .; - URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=22696 (дата звернення: 11.07.2017).

3. Дидишко Є.І. Динаміка показників іммуноантіоксідантного статусу у пацієнтів з гіпотиреозом на тлі ТЕС-терапії / Є.І. Дидишко, О.С. Охременко, В.Д. Левічкін // Кубанський науковий медичний вісник. - 2014. - № 4. - С. 50-54.

4. Вплив ТЕС-терапії на наслідки гострого адреналінового пошкодження серця у щурів / Трофименко А.І. [И др.] // Кубанський науковий медичний вісник. - 2013. - № 5 (140). - С. 174-180.

5. Каркіщенко В.Н. Методики вивчення фізіологічних функцій лабораторних тварин для доклінічних досліджень в спортивній медицині // Біомедицина. - 2012. - №. 4. - С. 15-21.

6. Paxinos G. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates / G. Paxinos, C. Watson. - 6th edition. - Academic Press, 2007. - 456 p.

7. McKlveen JM, Myers B., Herman JP The medial prefrontal cortex: coordinator of autonomic, neuroendocrine and behavioural responses to stress // Journal of neuroendocrinology. - 2015. - Vol. 27. - No. 6. - Р.446-456.

Транскраниальная електростимуляція (ТЕС-терапія) надає системне стрес-обмежуючого впливу на нейроіммуноендокрінную регуляцію, пов'язане з посиленням синтезу і секреції β-ендорфіну, а також модуляцією роботи серотонінергічного, дофамінергічних та холінергічного механізмів [1-4]. В одиничних роботах показана можливість ТЕС-терапії пригнічувати гіперактивацію нейронів стрес-респонсівних структур мозку (відтворену в посиленні експресії гена c-fos) [1]. Однак існує необхідність розширити і доповнити уявлення про цей аспект антистрессорного ефекту даного методу. А саме, вивчити характер активації нейронів медіальної префронтальної кори (мПФК), найважливішого координатора високоорганізованої обробки інформації про психогенні стресора, на моделі комбінованого стресу (надзвичайно часто має місце in natura) і вплив ТЕС-терапії на цей процес.

Метою нашої роботи є вивчення можливості корекції ТЕС-терапією вираженості індукованої комбінованим стресом експресії c-fos нейронами медіальної префронтальної кори щурів.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження було проведено на 50 дорослих білих нелінійних щурах-самцях масою 200-250 г. Утримання тварин і постановка експериментів проводилися відповідно до вимог Наказу № 199н МОЗ РФ від 01.04.2016 р та Міжнародними рекомендаціями щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням лабораторних тварин (1985).

Період адаптації перед експериментом для всіх щурів становив 7 днів. Тварини интактной групи не включалися в експеримент, забір матеріалу проводився в перший день після адаптації. Оцінка витривалості, працездатності і стресостійкості інших щурів проводилася в перший день після адаптації за допомогою модифікованого НЦБМТ РАМН (Науковий центр біомедичних технологій) тесту вимушеного плавання (плавального тесту) [5]. Для цього скляний акваріум, квадратний в перетині (довжина сторони 30 см), заповнювався водою (висота водяного стовпа 40 см, температура води 28 ° C). До хвоста тварини прикріплювався вантаж (10% від маси тіла). Тварина поринала в акваріум і після втоми витягувалися з води. Критеріями стомлення були відмова від плавання, неможливість спливання на поверхню і адинамія більше 10 секунд [3]. Оцінка стресостійкості здійснювалася за часом плавання до стомлення. В експеримент включалися щури, тривалість плавання яких не відхилялася від середнього часу більш ніж на 35% [5]. Після цього тварини випадковим чином поділялися на дві групи: основну (ТЕС-терапія з 2-го по 6-й день, n = 20) і групу порівняння (без ТЕС-терапії, n = 20). За винятком ТЕС-терапії, все релевантні умови утримання, маніпуляції і процедури, що здійснюються над тваринами основної групи і групи порівняння, були ідентичні. ТЕС-терапія проводилася за методикою, описаної нами раніше [2].

На 7-й і 8-й дні моделювався комбінований стрес. Для цього використовувалися тест вимушеного плавання в модифікації НЦБМТ РАМН, вироблений на 7-й день, і ортостатический стрес на 8-й день. Ортостатический стрес (ОС) включав в себе фіксацію щурів в спеціальних футлярах з оргскла (обсяг 0,75 × 10-3 м3) вниз головою під прямим кутом до горизонтальної поверхні. ОС поєднувався, таким чином, з іммобілізацією. Час перебування в антиортостатическом положенні становило 45 хвилин. Через 2 години після ОС проводився забір матеріалу. Перед цим тварина наркотизуйте, використовуючи золетіл 0,8 мг на 100 г ваги щура в / м (Virbac, Франція), ксиланів 0,8 мг на 100 г ваги щура в / м (ЗАТ «НІТА-ФАРМ», Росія, Саратов) [2]. Глибину наркозу верифікувати з придушення рогівкового рефлексу і зникнення реакції на больові подразники.

Оцінка експресії c-fos в префронтальної корі проводилася імуногістохімічним методом. Після вилучення головний мозок фіксувався іммерсійним методом в 10% -ному нейтральному забуференном формаліні. Дегідратація і висновок в парафін здійснювалися за стандартною методикою за допомогою гістопроцессора TP1020 (Leica, Germany) і модульної установки EG1150H (Leica, Germany). Cрези товщиною 5 мкм, виготовлені за допомогою ротаційного мікротома RM2235 (Leica, Germany), піддавалися депарафінізації і регідратації. Ендогенна пероксидазна активність блокувалася додаванням 3% -ного розчину H2O2. Температурне відновлення епітопи здійснювалося експозицією в розчині Access Rodent (Menarine diagnostics, Italy) при температурі 95 ° C (40 хвилин). Неспецифічна иммунореактивность блокувалася додаванням розчину Rat Background Block (Menarine diagnostics, Italy). Зрізи инкубировались при кімнатній температурі протягом 1 години з первинними поліклональними кролячими анти-Fos антитілами (1: 100, ab209794, Abcam, UK). Для негативного контролю замість первинних антитіл додавався фосфатний буферний розчин. Детекція білка інтересу здійснювалася за системою ABC (avidin-biotin complex). Після інкубації з біотінілірованние козячими антитілами (ab64261, Abcam, UK) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, і чотирикратної відмивання фосфатним буферним розчином додавався стрептавидин, кон'югований з пероксидазою хрону (ab64261, Abcam, UK) на 10 хвилин при кімнатній температурі. Потім зрізи промивалися 4 рази, і додаванням DAB хромогену на 5 хвилин виявлявся білок інтересу. Після цього проводилися чотириразова відмивання фосфатним буферним розчином, що контрастує фарбування, дегідратація в спиртах висхідної концентрації та ксилоле і висновок зрізів в монтують середу ConsulMount (Thermo Fisher Scientific, USA). Реакція вважалася позитивною при появі коричневого забарвлення.

Ідентифікація рівнів зрізів і кордонів анатомічних структур здійснювалася за допомогою стереотаксичних атласів мозку щура [6]. Вивчення зрізів і отримання фотографій проводилось за допомогою мікроскопа Olympus IX51 (Olympus, Japan). Зображення, що мають однакові збільшення і дозвіл, зберігалися у вигляді окремих файлів у форматі tiff без стиснення. За допомогою графічного редактора GNU Image Manipulation Program (Free Software Foundation, USA) вироблялося вирівнювання експозиції і нормалізація по балансу білого. Підрахунок імунореактивних клітин проводився в симетричних відділах кори обох півкуль. У кожній півкулі вивчалися 6 фіксованих областей площею 0,0625 мм2 (0,25 × 0,25 мм), що включали в себе поверхневі (прилеглі серединним структурам) і глибокі шари (прилеглі forceps minor corporis callosi) передньої цінгулярной кори (АС), інфралімбіческой кори (IL) і прелімбіческой кори (PL). Як орієнтир використовувався рівень, віддалений в передньо-задньому напрямку від брегми на 3 мм (рис. 1). Для морфометрического аналізу зображення використовувалася програма ImageJ 1.50i (National Institutes of Health, USA). Після перетворення (Treshold) 8-бітових зображень в маски проводився автоматичний підрахунок часток (Analyze Particles). Враховувалися частинки розміром більше 4 пікселів (які відповідали 8,9 мкм2 на реальному препараті). Автоматичний аналіз доповнювався ручним методом. Дослідник, який виробляв підрахунок, не мав інформації про приналежність щури до тієї чи іншої групи.

Мал. 1. Аналізовані області медіальної префронтальної кори (позначені сірими прямокутниками); СС - corpus callosum, fmi - forceps minor corporis callosi (з [6] і [7] зі змінами)

Статистична обробка отриманих даних проводилася за допомогою пакета програм STATISTICA (StatSoft, USA). Гіпотеза про вигляді розподілу перевірялася за допомогою критерію Шапіро-Уілкі. Оскільки закон розподілу отриманих значень відрізнявся від нормального, дані представлялися у вигляді медіани (Me), верхнього (75%) і нижнього (25%) квартилей (Q1-Q3), а для виконання завдання порівняння двох незалежних груп використовувався непараметричний U-критерій Манна -Уітні. Критичний рівень значущості нульової статистичної гіпотези відповідно до прийнятих в медико-біологічних дослідженнях критеріями приймався рівним 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Як випливає з таблиці, кількість Fos-позитивних клітин у всіх досліджуваних регіонах префронтальної кори тварин групи порівняння перевищувало таке в основній групі, що відображає здатність ТЕС-терапії попереджати і зменшувати стрес-індукованої гіперактивацію досліджуваних структур.

Кількість імунореактивних клітин в досліджуваних областях префронтальної кори

У порівнянні з основною групою: * - p = 0,002, ** - p = 0,0008, *** - p = 0,0005, # - p = 0,001, ## - p = 0,004, ### - p = 0,0003.

На малюнку 2 представлені приклади зображень поверхневих і глибоких шарів AC, PL і IL.

Мал. 2. Приклади зображень поверхневих (праворуч) і глибоких (зліва) шарів АС, PL і IL. Білими трикутниками позначені приклади Fos-позитивних клітин, fmi - forceps minor corporis callosi

Медійна префронтальная кора є найважливішим координатором стресових реакцій [7]. Анатомічно мПФК щури підрозділяється на три регіони, відмінних по цитоархітектоніка, зв'язків з іншими центрами і функцій: передню цінгулярной (AC), прелімбіческую (PL) і інфралібіческую (IL) кору, які гомологични полях Бродмана 24b, 32 і 25 відповідно. Більшість клітин мПФК (80-90%) - глутаматергіческой пірамідальні нейрони, які пов'язані з найважливішими стрес-реалізують системами: автономною нервовою системою (АНС) і гіпоталамо-гіпофізарно наднирникової віссю (ГДП). Передня цінгулярной кора залучена в регуляцію процесів просторового орієнтування, руху і сприйняття болю. Прелімбіческая кора має зв'язку з гипоталамическими структурами, ядрами шва, смугастим тілом, опорним ядром термінального тяжа і бере участь в когнітивному процессинге інформації про стресових стимулах, системі винагород тощо. Прелімбіческая кора, подібно гиппокампу, діє переважно інгібуючу дію на активацію ГГН осі і симпатичної нервової системи при психоемоційному стресі і діє в більшому ступені на тривалість, ніж на інтенсивність продукції глюкокортикоїдів. Білатерально пошкодження даного регіону, так само як і передній цінгулярной кори, пов'язане з гіперактивацією ПВЯ при іммобілізації, але не при інгаляції ефіру (фізичний стрес). Інфралімбіческая кора пов'язана з вентролатерального регіонами довгастого мозку, ядром одиночного шляху, центральним амігдалярного ядром і надає стимулюючу дію на стрес-реалізують системи.

Мал. 3. Місце медіальної префронтальної кори в реалізації реакцій стресу.

Ах - ацетилхолін, ВЛМ - вентролатерального відділи довгастого мозку,

ГАМК - гаммааминомасляной кислота, глу - глутамат, КТРГ - кортикотропного рилізинг-гормон, ма - моноаміни, мПФК - медійна префронтальна кора, ОТТ - опорна ядро ​​термінального тяжа, ПВЯ - паравентрикулярное ядро ​​гіпоталамуса, Цая - центральне амігдалярного ядро, NTS - nucleus tracti solitarii

Медійна префронтальная кора пов'язана з ГГН віссю не безпосередньо, а через ряд структур, наприклад прелімбіческая кора - через опорне ядро ​​термінального тяжа, нейрони якого, в свою чергу, посилають ГАМК-ергічні проекції кортиколиберин-які продукують клітинам паравентрикулярного ядра гіпоталамуса. Структура, що зв'язує інфралімбіческую кору і ГДП вісь, не відома; існують докази, що дану роль можуть виконувати опорна ядро ​​термінального тяжа, задній гіпоталамус і ядро ​​одиночного шляху [7]. Клітини префронтальної кори мають численні глюкокортікоїдниє і мінералокортикоїдні рецептори і беруть участь в обмеженні реакцій стресу за принципом негативного зворотного зв'язку. Імплантація ГК в префронтальну кору пригнічує активність ГГН осі (даний ефект також має місце тільки при психоемоційному стресі). Медійна префронтальная кора (разом з гиппокампом і мигдалеподібні тілом) є найважливішим координуючим центром в ієрархії обробки інформації про психогенні стресора, прийняття рішень і регуляції поведінкового відповіді на стрес і становить частину так званого соціального мозку (рис. 3). Порушення роботи мПФК лежать в основі багатьох форм стрес-асоційованих розладів, включаючи велике депресивний розлад (БДР) і посттравматичний стресовий розлад (ПТСР). Відомо, що нейрони 25 поля Бродмана метаболічно гіперактивні при БДР, а глибока стимуляція даного регіону пов'язана зі зменшенням вираженості симптомів у пацієнтів з депресією, стимуляція же гомологічних ділянок префронтальної кори щурів сприятливо позначається на показниках в тесті вимушеного плавання.

висновок

Результати цього дослідження вказують на те, що ТЕС-терапія попереджує та зменшує гіперактивацію передній цінгулярной, прелімбіческой і інфралімбіческой кори при комбінованому стресі. Це співвідноситься з даними попередніх робіт і закладає теоретичний фундамент клінічного вивчення ефективності ТЕС-терапії при БДР і ПТСР.

бібліографічна посилання

Каде А.Х., Поляков П.П., Ліпатова А.С., Сотниченко А.С., Куєвда Є.В., Губарева Е.А. ХАРАКТЕР ЕКСПРЕСІЇ C-FOS нейронів МЕДІАЛЬНОЇ префронтальної кори В УМОВАХ КОМБІНОВАНОГО стресу І ВПЛИВУ ТЕС-ТЕРАПІЇ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 5 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26877 (дата звернення: 31.05.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)