Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Незважаючи на те, що ця технологія може бути використана для вимірювання змін в глутаматергіческіх сигнализациях у багатьох видах тварин моделей, такі як черепно-мозкової травми, старіння, стрес і епілепсії, тут ми покажемо, як технологія MEA може бути використана для вивчення глутаматергіческіх змін в моделі трансгенної миші людської таупатіі 19,20. РТГ (TauP301L) 4510 миші висловлює мутацію P301L в тау, пов'язаний з лобно-скроневої деменції і паркінсонізмом, пов'язаної з хромосомою 17, і зазвичай використовується для вивчення тау патології, пов'язану з хворобою Альцгеймера, нейродегенеративних тауопатіямі і лобно-скроневої деменції. Ми також показали, що передача сигналів глутаматергіческіх можуть бути змінені фармакологічного втручання. Ми лікували мишей TauP301L з рилузолом, УОЙ затвердженим модифицирующим захворюванням препарату для бокового аміотрофічного склерозу (ALS), який модулює сигналізацію глутаматергіческіх шляхом стабілізацііінактівірует стан напруги натрієвих каналів, що призводить до зменшення вивільнення глутамату, і потенцированию поглинання глутамату через збільшення експресії глутамату - переносник, що призводить до збільшення зазору глутамату 30,31,32,33.

Ми вибрали саме цей набір даних для демонстраційних цілей з чотирьох причин. По-перше, цей набір даних показує тимчасовий дозвіл системи, як показано на нашу здатність виміряти швидко динаміку перехідних процесів вивільнення та поглинання глутамату. Крім того, ця доклінічна тваринна модель демонструє зміни в тоническом глутамат, вивільненні глутамата, і кліренс глутамату, що дозволяє для прикладу змін в кожному такті. По-друге, використання цього набору даних, високу просторову роздільну здатність, яке дозволяє для вимірювання подобласть відмінностей в Д.Г., СА3, ай СА1 гіпокампу продемонстрована. По-третє, ці дані дозволяють для демонстрації того, як фармакологічне втручання може бути використано для пом'якшення глутаматергіческой змін, що спостерігаються в доклінічних моделях тварин. Нарешті, оскільки ця модель має доклінічні зміни в глутамат релізу, необхідність ретельної інтерпретації кліренсу глутамату в присутності зміненому вивільнення глутамату може бути пояснена.

Після досягнення стабільної базової лінії, як показано на <0,004 нА / хв зміни нахилу (10 - 20 хв), спочатку вимірювали рівень тонічного глутамату (мкМ) шляхом усереднення позаклітинних рівнів глутамату протягом 10 с до будь-якого застосування рішень. Ми спостерігали збільшення рівнів тонізуючого глутамату в СА3 і СА1 регіонах мише TauP301L і рилузол відновлені рівні глутамата тонічних, що і управління (рис 3А). Далі, KCl, був доставлений локально (через микропипетку) до кожного з трьох подобластей одного hemisphпрежде ніж кожні 2 - 3 хв. Після 10 відтворюваних сигналів, що свідчить про систему 34 нейрональних незайманий глутамату, результати були усереднені для кожної групи і середньої амплітуди в порівнянні. Характерні сліди (рис 3B) показали збільшення вивільнення глутамату у мишей TauP301L наступне застосування KCl у всіх трьох подобластей (показаний тільки СА3), ефект, який був врятований Riluzole лікування (рис 3C).

МЕМ потім переміщається в протилежному півкулі і дозволило досягти стабільної базової лінії (10 - 20 хв) перед екзогенний глютамат був застосований для вивчення глутамату зазор (Малюнок 4). Різні обсяги (50 - 250 нл) 200 мкМ стерильно відфільтрованого розчину глутамату були застосовані в позаклітинний простір кожні 2 - 3 хв, а чиста площа під кривою (AUC) була використана як міра поглинання глутамату. Це швидке застосування глутамату в Тхе позаклітинного простору дозволяє імітувати ендогенного вивільнення глутамату і вимірювання поглинання глутамату. Оскільки глутамат транспортери мають Міхаелісом-цементних кінетики 35, діапазон обсягів (50 - 250 нл) екзогенного глутамату впорскується піддавати відмінності в поглинанні. Для цього, кожна тварина отримує 1 - 2 ін'єкції з кроком 50 нл в межах 50 - від 250 нл. Хоча один завжди повинні підтвердити, що обсяг ін'еціруется в кожної групи по регіонах статистично не відрізняється при р ≤ 0,05 рівня, кращий спосіб, щоб забезпечити чисту AUC пов'язаний з поглинанням, а не кількість глутамату, застосованим чи дифузією, є забезпечення того, і амплітуда (фіг.4) і Т підйом (міра дифузії від точкового джерела (микропипетки) до МЕМ фіг.) не відрізняються 10,11,19,20. Це аллоWS для «піки» узгодження амплітуд (рис 4в) таким чином, що відмінності в чистій AUC передбачається з - за відмінності в поглинанні і не кількість нанесеного або дифузії. Пік відповідність є особливо важливим, коли тварини мають існуючі відмінності в вивільненні глутамата. Оскільки діапазон обсягів вводяться, дисперсія як для амплітуди і T підйому часто є більшою і додаванням додаткових тваринах не зменшує дисперсію для цих заходів, оскільки вони притаманні конструкціям. Оскільки амплітуда і Т підйом були подібні між групами в кожній підобласті (рис 4А, 4В), ми припускаємо, що відмінності в чистій AUC (рис 4C, 4D) обумовлені відмінності в поглинанні глутамату. Рілузол покращився кліренс глутамату в порівнянні з контрольною групою у всіх трьох подобластей (рис 4D). Нарешті, MEA з прикріпленою мікропіпеткою використовується для локально застосовувати барвник для підтвердження розміщення MEA після мозку секціонування, Як показано на фіг.3D.

Ці дані вказують на те, що технологія МЕМ здатний вимірювати вивільнення нейромедіаторів в невеликих подобласти гіпокампу 24,25, на відміну від попередніх методів (наприклад, мікродіалізние), які записуються тільки з великих площ зразка і часто пошкоджених нервових ланцюгів 28,29. Крім того, МПС надає нам з високим тимчасовим дозволом для вимірювання швидкої кінетики вивільнення глутамату і зазору 25.

Малюнок 1: In Vitro Калібрування автореферентності мікроелектродну вимірювань зміни ток (мкА) на глутамат Oxidase сайті (GluOx, червона) в порівнянні з дозорним (Sent; синій). Заважають аскорбінова кислота (АА: 250 мкм) і допамін (DA: 2 мкМ) не змінюють струм при будь-якому глутамат-оксидазу або сторожовий. Додавання глутамату (Glu: 20, 40, 60 мкм) викликало ступеневу збільшення струму на оксидази сайті глутамату, але ніяких змін на сайті дозорного. Перекис водню (H 2 O 2: 8,8 мкм) отримує збільшення струму на обох ділянках. Чутливість, нахил, межа виявлення, і R-значення були розраховані після калібрування. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 2. Приклад електрохімії листа. Ця таблиця включає стовпці час ін'єкції чи ін'єкції числа (TIME / TTL), координати мозку (AP, мл, DV), величина тиску застосовується (азот), довжина тиску (часу), а обсяг ін'єктують за допомогою ежектора тиску. Будь-які ноти, такі як непарні сигнали або засмічення микропипетки повинні бути записані в колонці приміток. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 3. позаклітинної Тонік і хлорид калію (KCl) -evoked вивільнення глутамату в Д.Г., СА3 і СА1 регіонів гіпокампу. (А) У СА3 і СА1 областях гіпокампу, тонічних рівні глутамата були значно збільшений в транспортному обробленому мишей TauP301L (Veh-TauP301L), ефект послаблюється Riluzole лікування. (В) Вихідні підібрана представницькі записи KCl-глутамат викликав вивільнення в СА3 показали г iluzole лікування (Ril-TauP301L) послаблюється значне збільшення амплітуди вивільнення глутамату, що спостерігається у мишей Вег-TauP301L. Місцеве застосування KCl (↑) отримує надійне збільшення позаклітинного глутамату, який швидко повертається в тонічні рівні. (C) значно збільшилася KCl-який викликав вивільнення глутамату спостережувану у мишей Вег-TauP301L в DG, СА3 і СА1 після того, як місцеве застосування KCl послаблялася з Riluzole лікування. (D) Cresyl фіолетово-забарвлені 20 мкм частини гіпокампу показує розташування MEA доріжок в СА3 і СА1 (середнє значення ± SEM; ** р <.01 Век-контроль в порівнянні з Veh-TauP301L, # р <.05 Ril-Тау P301L проти Veh-TauP301L, ## р <.01 Ril-TauP301L проти Veh-TauP301L; п = 14 - 19 / група). Ця цифра передруковано з дозволу John Wiley і Sons 19,20.rget = «_blank»> ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 4. Глутамат Засвоєння Після екзогенного глутамату Застосування в Д.Г., СА3 і СА1 регіонів гіпокампу. (А) Амплітуда локально прикладений сигнал глутамату була подібна серед груп в кожному регіоні. (В) Т підйом, індикатор дифузії глутамату з микропипетки, був подібним серед груп в кожному регіоні. (С) Представницькі глутамату сигнали в СА3 від місцевого застосування глутамату в VEH-Controls, Veh-TauP301L і мишей Ril-TauP301L. Лікування (D), рилузолом скоротили значне збільшення чистої площі під кривою (AUC), що спостерігається у мишей Вег-TauP301L у всіх 3-х областей гіпокампу, що вказує на поліпшення поглинання глутамату в Riluzole оброблених TМишей auP301L (середнє ± SEM; * р < 0,05 Вег-Control проти Veh-TauP301L, ** р <0,01 Вег-Control проти Veh-TauP301L, # р <0,05 Ril-TauP301L проти Veh- TauP301L, ## р <.01 Ril-TauP301L проти Veh-TauP301L; п = 13 - 15 / група). Ця цифра була передрукована з дозволу John Wiley і Sons 20. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

> 0,05 М PBS 2 л деионизированной води: Зберігати в скляному стакані обгорнуті фольгою. Доведіть рН до 7,4 за допомогою КОН, якщо це необхідно. NaH 2 PO 4 · H 2 O: 2,8 г Na 2 HPO 4: 11,34 г Хлорид натрію: 11,68 г 20 мМ аскорбінової кислоти 50 мл деіонізованої води: Зробити свіжий щодня. Аскорбінова кислота: 0,18 г 20 мМ L-глутамату 50 мл деіонізованої води: Зробити свіжий щотижня. L-глутамату мононатрієвої солі гідрату: 0,15 г 2 мМ Допамин Допамин гідрохлорид: 0,038 г Зробити свіжі щомісяця. 0,1 М хлорним кислоти: 10 мл Доведіть обсяг до 100 мл за допомогою деионизированной води 8,8 мМ перекису водню 50 мл деіонізованої води: Зробити свіжий щотижня. Перекис водню: 500 мкл 70 мМ хлорид калію 100 мл деіонізованої води: Зробіть свіжий день експерименту. Хлорид калію: 0,08 г хлорид натрію: 0,07 г хлорид кальцію: 0,004 г 200 μ; М Глутамат 20 мМ глутамату: 100 мкл Зробіть свіжий день експерименту. Стерильний фізіологічний розчин: 10 мл

Таблиця 1: Калібрування рішення.