Хімія і Життя - Електронний мікроскоп, точний розрахунок і холодний зразок

1. Початок великого шляху
2. Посилити сигнал і розшифрувати
3. Спостереження не повинно змінювати об'єкт
4. Нобелівські лауреати 2017 року

Лауреатами Нобелівської премії з хімії за 2017 рік стали Жак Дюбоше (Університет Лозанни, Швейцарія), Йоахим Франк (Колумбійський університет, Нью-Йорк, США) і Річард Хендерсон (Кембридж, Великобританія). Нагороду вони отримали за «розробку методів Кріоелектронний мікроскопії високого дозволу, що дозволяють визначити структуру біомолекул в розчині». Прес-реліз Нобелівського комітету пояснює, що метод Кріоелектронний мікроскопії відкрив нову еру в біохімії і допоміг заповнити безліч прогалин в наших знаннях про молекулах життя.

Деякі інтернет-ресурси в день оголошення лауреатів відреагували на новину помітними заголовками, наприклад: «Нобелівську премію з хімії дали за миттєву заморозку біологічних зразків». Так що ж найважливіше в Кріоелектронний мікроскопії: процес заморозки, адаптація електронної мікроскопії до потреб біохімії, поєднання методів або щось інше?

Початок великого шляху

У 1968 році була опублікована заключна частина науково-популярної трилогії Георгія Гамова «Містер Томпкінс в країні чудес». Вона була написана в співавторстві з мікробіологом Мартинасом Ічасо і називалася «Містер Томпкінс всередині самого себе. Пригоди в новій біології ». У книзі розповідалося про те, як містер Томпкинс в супроводі сімейного лікаря вивчає клітинну будову свого тіла і плаває по своїм кровоносних судинах. Розповідаючи про деталі будови клітин, екскурсовод пояснював Томпкінс, що вся ця інформація отримана за допомогою електронного мікроскопа. Читачам ставало очевидним, що електронна мікроскопія вже дозволяє вивчати біологічні тканини і окремі клітини, отримувати зображення біологічних об'єктів з небаченою чіткістю і деталізацією. Насправді ще років десять тому вченим залишалося тільки мріяти про використання електронного мікроскопа для вивчення атомно-молекулярної архітектури біологічно активних молекул (адже вони все-таки істотно менше клітин).

1. На прикладі молекули ферменту глутаматдегідрогенази показано, як поліпшувалося дозвіл методів Кріоелектронний мікроскопії. Сьогодні вона дає можливість вивчати біологічні об'єкти в атомному дозволі (стрічкова структура білка на крайньому правому фрагменті малюнка).

Мрія збулася зовсім недавно, через чотири десятки років після поглиблення містера Томпкинса в самого себе, і це значною мірою заслуга Жака Дюбоше, Йоахима Франка і Річарда Хендерсона. Завдяки їх відкриттям ми можемо досліджувати всі деталі структури біомолекул безпосередньо в розчині (рис. 1).

Шлях електронної мікроскопії в біохімію ні усипаний трояндами. Незабаром після того, як в 1931 році Ернст Август Фрідріх Руска продемонстрував принцип роботи електронного мікроскопа - це принесло йому Нобелівську премію з фізики 1986 року, - угорський фізик Ладіслав Мартон написав статтю, в якій стверджував, що шанси застосування ЕМ-мікроскопії для вивчення біоматеріалів рівні нулю, оскільки «інтенсивне бомбардування живих клітин електронами призведе до їх руйнування» ( «Nature», 1934, 133, 911-911, doi: 10.1038 / 133911b0 ).

Не виключено, що саме завдяки Мартон перед Дюбоше, Франком і Хендерсоном постало складне, але, погодьтеся, приємна задача - підготовка нобелівських лекцій. В тому самому листі 1934 року в редакції «Nature» Мартон запропонував можливі методи адаптації електронної мікроскопії для дослідження біологічних об'єктів - заморозка або метод, що нагадує негативний контрастування. Зрозуміло, в той час подібні підходи були чистим теоретизування.

Рішення ще однієї проблеми Мартон не побачив: в робочій камері електронного мікроскопа з біологічного зразка випаровується вода і внаслідок цього змінюється структура білків і нуклеїнових кислот. Очевидні були й інші проблеми: біологічні об'єкти могли мати вкрай низьку контрастність при проходженні через них електронів з високою енергією; енергію електронного пучка можна було робити дуже високою також через небезпеку пошкодити біомолекул на хімічному рівні; щоб уникнути вторинного розсіювання електронів, потрібні не просто тонкі зразки, а ідеальний моношар досліджуваних об'єктів. Крім того, було ясно, що для запису зображень необхідні швидкі детектори - біомолекули здатні змінювати форму або навіть переміщатися через незначну дрейфу температури або взаємодії з бомбардують їх електронами.

Посилити сигнал і розшифрувати

У всякому разі, було зрозуміло, що для вивчення низькою контрастністю біоматеріалів потрібні електрони, що володіють як можна меншою енергією, - саме це стимулювало пошук нових підходів до підготовки зразків. Першим кроком до істотного збільшення якості зображення був метод негативного контрастування, розроблений в 1940-х роках і модифікований в наступні два десятка років ( «Journal of Applied Physics», 1945, 16, 459-465; doi: 10.1063 / 1.1707615. «Journal of Molecular Biology», 1965, 11, 403-423; doi: 10.1016 / S0006-3495 (89) 82799-7). Метод заснований на тому, що біологічний матеріал впроваджують в тонку аморфну ​​плівку солі важкого металу (наприклад, фосфату вольфраму), яка формує шаблон навколо біомолекул (в точній відповідності з їх формою). Цей шаблон розсіює навіть володіють низькою енергією електрони краще, ніж знаходиться всередині нього біологічний матеріал, він менше пошкоджується потоком електронів і не дає біологічних молекул змінювати форму під час їх вакуумної сушки.

Негативний контрастування зразків дозволило отримати детальну інформацію про будову бактерій, вірусів і клітинних органоїдів. Однак для більш дрібних об'єктів, наприклад молекулярних комплексів, можна було отримати в кращому випадку зображення «конверта», в який поміщені біомолекули (дозвіл обмежено величиною зерна шаблону). І все ж це був крок вперед.

Внесок в адаптацію методів електронної мікроскопії для біологічних об'єктів вніс в тому числі і Аарон Клуг, який отримав в 1982 році Нобелівську премію з хімії «за розробку методу кристалографічної електронної мікроскопії та прояснення структури біологічно важливих комплексів нуклеїнова кислота - білок». Він одним з перших прийшов до того, що для уточнення тривимірної структури об'єкта, отриманої за допомогою методу негативного контрастування, потрібно зіставити його двовимірні проекції з різних сторін - це можна зробити, змінюючи кут, під яким на зразок направляється потік електронів. У 1960-х роках Клуг вивчив таким чином тонкі кристали каталази ( «Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie», 1970, 74, 1129-1137; doi: 10.1002 / bb pc.19700741109 ).

У 1968 році Клуг спільно з Давидом Дерозьє повідомили про перший вдалому прикладі: вони вирахували тривимірну модель біологічного об'єкта, виходячи з двовимірних проекцій, отриманих за допомогою електронного мікроскопа. Дослідники вивчили хвіст бактеріофага T4 - його вибрали з-за спиралевидной симетрії, тобто для нього тривимірну модель можна було побудувати, аналізуючи лише одну двовимірну проекцію, оскільки вона однакова під будь-якими кутами ( «Nature», 1968, 217, 130-134; doi: 10.1038 / 217130a0 ).

Щоб отримати інформацію про тривимірну структуру частинок, що не володіють спиралевидной симетрією, потрібні комбіновані дані від декількох двовимірних проекцій цих частинок. У 1970 році Клуг з Дерозьє і Ентоні Краутер розробили «підхід загальних ліній», за допомогою якого визначили тривимірну структуру ікосаедрічеськая капсидов вірусів ( «Proceedings of the Royal Society of London», 1970, A 317, 319-340; doi: 10.1098 / rspa.1970.0119 ). В роботі передбачалося, що аналогічний метод можна застосувати до несиметричним часткам, але все-таки більш точні результати він дає при аналізі симетричних зразків.

Спостереження не повинно змінювати об'єкт

Ще один крок до застосування електронної мікроскопії в біохімії був зроблений, коли вдалося зберегти в камері електронного мікроскопа гідратована стан біомолекули, а також сам аналізований об'єкт в цілості й схоронності. Для цього Дональд Парсонс розробив конструкцію камер, в яких підтримувалися певна вологість і кімнатна температура ( «Science», 1974, 186, 407-414; doi: 10.1126 / science.186.4162.407 ). У цих камерах він досліджував кристали ферменту каталази і знайшов умови, при яких опромінення електронами не впливає на будову білка.

У 1970-ті роки Роберт Глезер зміг кількісно оцінити ступінь пошкодження кристалічної каталази і низькомолекулярних органічних сполук при опроміненні потоком електронів. Він прийшов до висновку, що енергія випромінювання, здатна зашкодити невелика кількість досліджуваних об'єктів, рівномірно розподілиться між великою кількістю біомолекул одного і того ж типу ( «Journal of Molecular Biology», 1975, 94, 425-432; doi: 10.1016 / 0022-2836 (75) 90212-0 ). Був ще один спосіб, який міг одночасно знизити швидкість випаровування води і захистити біологічний матеріал від пошкодження електронним пучком, - охолодження об'єкта. У 1950-1960-х роках Умберто Моран вивчав можливості заморозки зразків і приготування надзвичайно тонких препаратів для кріо-електронної мікроскопії ( «Annals of the New York Academy of Sciences», 1960, 85, 689-713; doi: 10.1111 / j.1749-6632.1960.tb49990.x ). Однак вода зазвичай замерзає з утворенням дрібних кристаликів льоду, на яких відбувається дифракція електронів, а це сильно спотворює сигнали, не кажучи вже про те, що кристали можуть змінити будову об'єкта. Базиль Люе запропонував знизити негативний вплив холоду на біологічні зразки, прискоривши заморозку, - при цьому вода твердне, формуючи НЕ кристалічну, а аморфну ​​тверду структуру. У 1960-і роки швидку заморозку застосували для вивчення білків за допомогою рентгеноструктурного аналізу. Утворенню крижаних кристалів також перешкоджає додавання в зразок антифризів - сахарози або гліцерину ( «Acta Crystallographica B», 1970, 26, 998-1004; doi: 10.1107 / S0567740870003485 ).

Трохи пізніше Глезер і Кеннет Тейлор показали, що при швидкому заморожуванні можна за допомогою електронної мікроскопії розглянути кристали каталази і отримати картинку з роздільною здатністю в 3Å, не використовуючи контрастування. Доступна в той час технологія заморозки дозволяла проводити дослідження при температурі вище -120 про C - при цій температурі аморфний лід повинен перетворюватися в кристалічний. Проте в умовах експерименту кристалики льоду не утворювалися - як припустили дослідники, через те, що вода взаємодіє з поверхнею білка ( «Nature», 271, 1978, 659-660; doi: 10.1038 / 271659a0 ). Тейлор і Глезер також придумали, як зберігати біологічні зразки при низьких температурах, і довели, що охолодження зразка збільшує його інформаційну ємність.

Після цього розвиток методів, що дозволяють вивчати біомолекули за допомогою електронної мікроскопії, на якийсь час припинилося - до 1990-х років істотних модифікацій не було.

Нобелівські лауреати 2017 року

Однак людина влаштована так, що йому завжди хочеться більшого. Початок 1990-х років цілком можна вважати віхою в розвитку Кріоелектронний мікроскопії - Річард Хендерсон з колегами вперше продемонстрував, що з її допомогою можна отримати високоякісні зображення біологічного об'єкта, поєднуючи і усредняя його різні зображення (рис. 2).

У своїй першій роботі Хендерсон отримав якісну інформацію про будову бактериородопсина, використовуючи результати відразу з декількох електронних мікроскопів, що знаходяться в різних наукових центрах. При цьому він оптимізував інформацію, отриману з кожного пристрою ( «Journal of Molecular Biology», 1990, 213, 899-929; doi: 10.1016 / S0022-2836 (05) 80271-2 ). В процесі виявився ряд технічних обмежень, властивих цим мікроскопів, а також проблеми, пов'язані з приготуванням зразків. Хендерсон зробив висновок, що пристрій електронних мікроскопів та підготовку зразків треба принципово змінити і тоді Кріоелектронний мікроскопія перетвориться в рутинний метод визначення будови біологічних препаратів. З його допомогою можна буде вивчати в тому числі асоціати біомолекул, що не володіють кристалічною і симетричною структурою. Головна проблема дослідження асиметричних частинок, які розташовуються без формування далекого порядку, в тому, що важко вловити слабкий сигнал, який така частка генерує (вимірюється співвідношення сигнал-шум), і відповідно визначити положення і орієнтацію частки в зразку. Однак комп'ютерна техніка, доступна дослідникам в 1990 році, і не могла вирішити таке завдання ( «Journal of Structural Biology», 1999, 128, 3-14; doi: 10.1006 / jsbi.1999.4172). У наступне десятиліття методи, подібні до тих, що застосував Хендерсон, використовувалися й інші групи вчених, вони отримали в тому числі якісні зображення светопоглощающего комплексу хлорофіл-білок, тубулінових димера і аквапорінов.

Приклади структур біологічно активних сполук, вивчених за допомогою Кріоелектронний мікроскопії до травня 2016 роки ( «Cell», 2016, 165, 1698-1707; doi: 10.1016 / j.cell.2016.05.040)

Через п'ять років після виходу статті про структуру бактерії-родопсина Хендерсон представив детальний аналіз завдань, який потрібно вирішити для того, щоб отримувати з високою роздільною здатністю картинки ассоциатов біологічно активних молекул, що не формують кристалічні структури ( «Quarterly Reviews of Biophysics», 1995, 28, 171-193; doi: 10.1017 / S003358350000305X). Він зробив висновок, що потрібно застосовувати малоінтенсивне Недеструктивні опромінення електронами і використовувати фазовий контраст, - це дозволить визначити двовимірне положення індивідуальних частинок в площині двовимірного кристала і їх тривимірну орієнтацію. Правда, тільки в тому випадку, якщо частинки мають достатню молекулярної масою. Хендерсон вважав, що для біомолекул і ассоциатов біомолекул з молекулярної масою більше 50 килодальтон можна отримати зразок з достатньою кількістю частинок (близько 10 000) і визначити їх будова за допомогою електронної мікроскопії з атомним дозволом ~ 3 Å. До початку XXI століття Глезер прийшов до висновку, що мінімальне значення молекулярної маси об'єкта, який можна проаналізувати з дозволом в три ангстрема, - 20 килодальтон ( «Journal of Structural Biology», 1999, 128, 3-14; doi: 10.1006 / jsbi. 1999.4172). Правда, біомолекули з такою молекулярної масою поки ще нікому не вдалося вивчити, а найлегша молекула, будова якої допоміг встановити електронний мікроскоп, - гемоглобін, 64 кДа ( «Nature Communications» 2017, 8, 16099; doi: 10.1038 / ncomms16099). Але все-таки дозвіл, з яким вдається розглянути будову деяких молекул, вже менше 2 Å (рис. 3).

Другий нобелівський лауреат 2017 року, Йоахім Франк, ще в середині 1970-х років став займатися фундаментальною проблемою вивчення неконтрастірованних, некристалічних асиметричних частинок, випадковим чином орієнтованих в розчині ( «Ultramicroscopy», 1975, 1, 159-162; doi: 10.1016 / S0304 -3991 (75) 80020-9). Франк вважав, що треба «створити умови для посилення тих ознак частинок, сигнали яких можуть бути чітко помітні на тлі значних шумів».

У 1977 році Франк з колегами описав, як забезпечити таке посилення - взаємної кореляцією сигналів від різних частинок ( «Ultramicroscopy», 1977, 2, 219-227; doi: 10.1016 / S0304-3991 (76) 91385-1). Невпорядковане розташування частинок можна визначити за допомогою пучків електронів, потужність яких недостатня для руйнування об'єктів, і потім вибудувати зображення з високою роздільною здатністю, усереднивши сигнали від кожної частки. Рішення було правильним, що і продемонстрували при вивченні будови ферменту глутамінсінтетази ( «Ultramicroscopy», 1978, 3, 283-290; doi: 10.1016 / S0304-3991 (78) 80038-2).

В ідеалі для некристалічних зразків, що складаються з однакових часток, потрібно не так вже й багато інформації, яка описує їх положення в умовній площині і орієнтацію в тривимірному просторі, - щоб вирішити таку задачку, потрібно визначити лише п'ять параметрів. Однак реальні біологічні системи відрізняються від ідеалізованої математичної моделі тим, що утворюють їх частки рідко бувають абсолютно однаковими і часто містять домішки. Тому доводиться створювати уточнені математичні моделі, які враховують неоднорідність досліджуваної системи, і створювати алгоритми, що сортують результати дослідження об'єкта і враховують, які сигнали можна використовувати далі для побудови усередненої картини, а від яких слід позбутися. У 1981 році Франк з колегами описав метод, що дозволяє сортувати образи частинок на підставі їх орієнтації в просторі і особливостей будови ( «Ultramicroscopy», 1981, 6, 187-194; doi: 10.1016 / 03043991 (81) 90059-0). У цьому ж році він узагальнив математичні моделі в комп'ютерній програмі SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields - система для обробки даних електронної мікроскопії та пов'язаних областей, «Ultramicroscopy», 1981, 6, 343-357; doi: 10.1016 / S0304-3991 (81) 80236-7). Цей програмний пакет для обробки зображень, отриманих за допомогою електронної мікроскопії, існує і оновлюється досі ( https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html) . Більш того - програми безкоштовні, що, безумовно, полегшує роботу вчених в усьому світі.

Як вже згадувать, Вчені очікувалі, что швидке охолодження бланках позбавіть Електрон мікроскопію від багатьох обмежень и дозволити застосовуваті ее до біомолекул. Проблему крижаних кристалів планували подолати за допомогою швидкої заморозки, однак до 1980-х років принципова можливість отримання твердої стеклообразной води була під питанням - вчені думали, що необхідна для цього швидкість охолодження ніколи не буде досягнута.

У 1980 році дискусії на цю тему закрили - дослідникам вдалося заморозити мікрометровие краплі води, перевівши її в склоподібний стан ( «Nature», 1980, 288, 569-571; doi: 10.1038 / 288569a0 ). Роком пізніше Жак Дюбоше і Аласдер Макдауелл отримали тонку плівку твердої некристалічні води. Біооб'єкти, заморожені в такій плівці, можна буде вивчати за допомогою електронної мікроскопії ( «Journal of Microscopy», 1981, 124, 3-4; doi: 10.1111 / j.1365-2818.1981.tb02483.x ).

Методика приготування зразка для Кріоелектронний мікроскопії

Метод полягав в наступному: воду розпорошували на вуглецеву плівку, поверх якої була розміщена сітка, і все швидко занурювали в рідкий етан або пропан з температурою близько -190 про C (її підтримували за рахунок охолодження рідким азотом). Виявилося, що тонкий шар склоподібного твердої води однорідно поглинав електрони. Від аморфного стану води до кристалічному можна було перейти, нагріваючи зразок до -140 о C. У наступні роки Дюбоше удосконалив метод заморозки і приготування зразка для електронної мікроскопії, а також описав результати докладних досліджень чистої води, водних розчинів і суспензій бактеріофагів і молекул ДНК при кріогенних температурах ( «Journal of Microscopy», 1982, 128, 219-237; doi: 10.1111 / j.1365-2818.1982.tb04625.x ).

Метод Дюбоше оцінили в 1984 році, коли його група опублікувала електронні мікрографії суспензій вірусів ( «Nature», 1984, 308, 32-36; doi: 10.1038 / 308032a0 ). Методика дозволяла отримувати досить тонкі шари води для швидкого перетворення в склоподібний стан, але при цьому і досить товсті, щоб в цьому шарі міг поміститися моношар біологічно активних молекул або молекулярних комплексів в їхньому природному конформації (рис. 4).

Кріоелектронний мікроскопія в наші дні

В останнє десятиліття істотно покращилися конструкційні елементи електронних мікроскопів. Зараз в них застосовують нові детектори, що дозволяють реєструвати меншу кількість електронів, нові електронні гармати (джерела електронів) і нові камери, які практично виключають коливання температури, що впливають на точність дослідження. Вся ця модернізація значно підвищила співвідношення сигнал-шум і збільшила швидкість аналізу зразка - в результаті окремі микрографии можна склеїти в «фільм» з життя молекул. Все це, як і припускав Хендерсон в минулому столітті, перетворило електронну мікроскопію в поширений і доступний метод дослідження, що застосовується повсюдно, від матеріалознавства до дослідження біологічних систем.

Справжній розквіт Кріоелектронний мікроскопії як методу для вивчення біооб'єктів починається з 2012-2013 років і пов'язаний з появою прямих електронних детекторів; з їх допомогою був, наприклад, детально вивчений іонний канал клітинної мембрани TRPV1 ( «Nature», 2013, 504, 107-112, doi: 10.1038 / nature12822 ). І нарешті, зовсім недавно, в 2017 році, - за все через чотири роки після опублікування перших статей, які стали основою для створення Кріоелектронний мікроскопії високого дозволу, - цей метод дозволив, як ми вже згадували, досліджувати молекулу гемоглобіну в розчині ( «Nature Communications» 2017, 8, 16099; doi: 10.1038 / ncomms16099 ). Майже шість десятиліть минуло з тих пір, як Джон Кендрю і Макс Перуц визначили будову міоглобіну і гемоглобіну методом рентгенівської кристалографії (саме завдяки цій роботі в 1962 році вони стали нобелівськими лауреатами).

За півстоліття пройдено довгий шлях. Для вивчення біологічної молекули методом Кріоелектронний мікроскопії немає необхідності готувати її кристалічний зразок, а значить, для аналізу потрібно дуже невелика кількість речовини. Метод дозволяє аналізувати частинки з масою в діапазоні від десятків килодальтон до декількох мегадальтон. Різновид методу - Кріоелектронний томографія може вивчати і більш великі об'єкти, від комплексу біологічно активних молекул до клітинного органоида і навіть клітини. Кріоелектронний мікроскопія вивчає не тільки статичні структури. Іонний фон, концентрацію низькомолекулярних речовин і рН охлаждаемого для аналізу розчину можна систематично міняти, що дає можливість визначати структуру біооб'єктів в оточенні, максимально близькому до природного. Метод Кріоелектронний мікроскопії навіть робить видимими зміни будови ферменту, що каталізує реакцію ( «Nature», 2015-го, 521, 241-245; doi: 10.1038 / nature14365 ). Практичне використання очевидні: детальне дослідження біохімічних процесів, вивчення будови патогенних вірусів, створення нових і модифікації існуючих лікарських препаратів.

В історії біохімічних застосувань Кріоелектронний мікроскопії, ймовірно, знайдуться десятки імен, гідних згадки. Однак лауреати Нобелівської премії 2017 року - Жак Дюбоше, який розробив метод приготування зразків для Кріоелектронний мікроскопії, Йоахім Франк, який придумав математичні методи обробки сигналів від ансамблів частинок в розчинах, і Річард Хендерсон, вперше продемонстрував можливість застосування Кріоелектронний мікроскопії для визначення структур біомолекул з високою роздільною здатністю, - дійсно внесли величезний внесок у створення технологій для подорожей в глибини живої матерії.