Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Описані тут методи були схвалені Leetown науковий центр інституційний догляд тварин і використання Комітетом.

1. риба колекція

1. Зберіть живої риби з мінімальним стресом. Використання човна або рюкзак електролов, гак і лінії або мереж.
2. Утримуйте рибу в живій свердловин або пористий контейнерів до вибірки.
   Примітка: Американське суспільство рибальства опублікував ряд посібників для риб збору, обробки і анестезії / евтаназіі26,27,28. Одягайте рукавички при обробці риби.

2. риба патанатомія

1. Приспати риби.
   1. Місце риби в анестезії, до тих пір, поки opercular рух припиняється і риба втрачає рівновагу. Після ще 2 - 10 хв риба буде бути euthanized; Однак це також залежить від виду.
      Примітка: Риба може бути euthanized ряду анестетиків (див. Таблицю матеріали для найбільш часто використовуваних). Метод евтаназія буде залежати від лабораторних вимірювань, які будуть проводитися на тканинах собрани29.
2. Міра біометричних характеристик.
   1. Вага риби до найближчого грама.
   2. Виміряйте довжину риби до найближчого міліметра.
      1. Міра Загальна довжина від кінчика рила з рот закритий до кінця хвоста спільно стискається.
      2. Виміряйте вилка довжина від вилки в хвіст на кінчику морда і Стандартна довжина від кінчика рила до кінця тіла (початок хвіст).
   3. Розрахуйте коефіцієнт за такою формулою:
      Коефіцієнт = (вага всього тіла - вага гонад) / Загальна дліна3.
      Примітка: Вага гонад віднімається з загальної ваги тіла так як гонад можуть істотно сприяти вага всього тіла, особливо в prespawn жінка риби.
3. Отримайте зразок крові.
   Примітка: Крові найчастіше беруться з хвостового вен, але може також бути виведені з спинний аорти або по серцевої прокол30.
   1. Витягти зразок периферичної крові з хвостового вен голкою 22 або 23 G на 1-5 мл шприц, в залежності від розміру риби. Вставте голку передували хвостового області нижче бічної лінії (рис. 1A і 1B). Кут його вгору до ураження хребта і потім зняти трохи. Вен черевної вищележачі хребта.
      Примітка: Якщо ви плануєте зробити мазків крові або сироватки не потрібно, використовується не антикоагулянту. У більшості випадків буде збір плазми і, отже, антикоагулянт гепарин натрію, ЕДТА або літій використовується для покриття голок і шприців і також в пробірки (наприклад, vacutainer).
   2. Видаліть голку і помістіть в контейнер утилізації Шарпс до здачі крові в колекції трубку.
      Примітка: Кров може проводитися на льоду, але завісящ на наступні аналізи слід якомога швидше, як возможних30центріфугіруют.
   3. Якщо буде оцінюватися ядерної аномалії або диференціального крові, відразу ж місце краплі крові на ковзаннях мікроскопа дублювати чисте скло. Назад в падіння, який потім звертається по всій поверхні капілярність другий слайд під кутом 45 °. Дозвольте висохнуть31.
   4. Центрифуга крові в 1500 - 2500 x g 15 хв відкладеннях клітини. Видалення плазми / сироватка з стерильних передачі піпетки, аліквотах в кріогенних флаконів і зберігати при температурі-80 ° C.

Малюнок 1: Отримання крові з риби. (A) A недавно вбиті риби укладається на його стороні і бічної лінії розташовані. (B) голчастий - вставленої вентральний до бічної лінії (стрілка), під кутом вгору до тих пір, поки голка торкнеться хребта. Потім злегка знімається, і всмоктування для вивести крові. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

1. Провести оцінку на основі патанатомія здоров'я на кожній риби.
   Примітка: Кількість публікацій, ілюстрації і опису пошкоджень і аномалії, доступни32,33,34,35.
   1. Документ зовнішніх відхилень, включаючи пошкодження на поверхні тіла і плавників (рис. 2), очі і зябра (рис. 3), зовнішніх паразитів, таких як п'явками (Малюнок 2D), личинки або Трематодние metacercarial кісти (Малюнок 2D, 3B) і Джилл паразитів (рис. 3D). Документ типу, розташування і розмір спостерігаються аномалії на аркушах даних, а також як фотографічно, якщо це можливо.
   2. Відкрийте за допомогою ножиці різання від анальної області кришечки і видаляючи шматок м'язів піддавати внутрішні органи черевної порожнини (рис. 4A).
      Примітка: Якщо передня нирки будуть зібрані для імунної функції (див. Крок 5 нижче) або зразки, зібрані для бактеріологічних досліджень або вірусології, поверхні зовнішнього тіла повинні бути продезінфіковані з 70% спирту і ці проби повинні бути отримані до розкриття. Якщо тканини використовуються тільки для візуальних спостережень, аналізу плазми і гістопатології стерилізації не є необхідним.
   3. Документ внутрішньої аномалії (рис. 4) включає загальні або фокуса знебарвлення різних органів (рис. 4B склад), наявність порушені райони (Малюнок 4E), кісти, паразитів і розмір (аномалії розширено, атрофувалися).

Малюнок 2: Приклади видимих уражень спостерігається на поверхні тіла і плавників риб. (A) A маленький, злегка еродованих поразки (стрілка) на поверхні бічних тіла. (B) A великий почервонілі області (стрілка) за участю поверхні хвостового тіла. (C) піднято, чорний поразки (стрілки) на поверхні тіла і плавників. (D) п'явок (біла стрілка) і маленькі чорні плями (чорні стрілки) на ребра. Шкали бар = 3 mm. (E) A піднято, ураження (стрілка) рослини, блідо на поверхні тіла. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: Приклади видимих пошкоджень зябра і очі риб. (A) A блідо-області (стрілка) в кришталику ока. Шкали бар = 5 mm. (B) білі кісти (білі стрілки) і маленькі чорні плями (чорні стрілки), викликані Трематодние паразитів на кришечки, що охоплюють зябра (). Шкали бар = 1 cm. (C) A блідий, ерозії в області (стрілка) на Гілл (). Шкали бар = 5 mm. (D) Гілл, яка була видалена показані паразитів (стрілки) надає Гілл ниток. Шкали бар = 2 mm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: Приклади патанатомія і внутрішніх аномалій риб. (A) під час патанатомія є розрізати рибу (уздовж білої стрілкою) і клапоть м'язів (чорна стрілка) видалені, щоб викрити гонад () і селезінки, утримуються щипцями і ножиці. (B) строкаті печінки (), насінників (b), шлунково-кишкового тракту, оточений жирової жиру (c) і шлунка (d). Шкали бар = 5 mm. (C) печінки (а) з темно червона площа (стрілка), яєчників (b) і кишечника (c). Шкали бар = 5 mm. (D) печінки з зеленуватим знебарвленими областях (стрілки). Шкали бар = 1 cm. (E) приклад звичайного () і аномальні яєчок (b) з підняті конкрецій. Шкали бар = 1 cm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

1. Отримайте hepatosomatic індекс (HSI).
   1. Видаліть печінку, розірвавши печінкової артерії і сполучної тканини переднього кінця. Обережно вийміть під час обрізки спайок та інші сполуки в кишечнику і жирової жиру. Подбайте, щоб не пробивайте жовчного міхура. Вага печінки.
      Примітка: Деякі риби, наприклад, коропові, не мають дискретні печінки, але швидше за печінкової тканини, загорнуті навколо кишечника та інших органів. Для цих видів він не може бути можливо отримати печінки ваг.
   2. Розрахуйте hepatosomatic індекс (HSI) за формулою:
      HSI = маса печінки вага / всього тіла
2. Розрахуйте індекс gonadosomatic.
   1. Видалення гонади і зважити його.
   2. Розрахуйте gonadosomatic індекс (GSI) за формулою:
      GSI = маса тіла вага / всього гонад

3. зберегти тканини для мікроскопічних патології

Примітка: Кількість фіксатори, включаючи нейтральних буферизації формаліну 10% і Z-fix, на основі формалін фіксатором з цинком, може використовуватися для збереження тканини в області. Останній є кращим, якщо такі методи, як в situ гібридизація або плямувати флуоресцентні антитіла можуть бути використані.

1. Ретельно вирізати, але не витягнути зразки тканин. Тримайте тканини окремих частин
2. Місце шматків будь-яких зовнішніх відхилень в контейнері фіксують. Крім того включати суміжні частиною нормальної тканини.
   Примітка: Неправильна обробка наприклад, стиснення або інші механічні пошкодження, тривалого впливу повітря або сонячного світла і заморожування може стати причиною перешкод.
3. Скоротити щонайменше п'ять 3-4 мм товсті шматки печінки з різних регіонів і місце в фіксують контейнер. Увімкніть нормальних і ненормальних областях, якщо спостерігається.
4. Залежно від розміру помістіть весь гонад або з декількох частин уздовж однієї гонад в фіксують контейнер.
5. Місце в контейнері фіксують або цілі органи, якщо малі, або шматки всі інші органи (селезінка, передній і задній нирок, зябра, серця, кишечника і шлунка). Якщо спостерігаються атипія тканин, зберегти прилеглих частиною нормальної тканини також.

4. Видаліть отоліти для аналізу віку

Примітка: Вік може бути важливою змінною в риб хвороби / риба медичних досліджень. Хоча ряд структур, включаючи ваги і колючки, були використані для визначення віку, більшість досліджень, порівняння структур знайшли отоліти дати кращі результати36,37. Костистих риб мають три пари отоліти - lapillus, sagitta і Астеріскус. Як правило отоліти сагітальній або lapillus збираються для старіння, хоча це може варіюватися від видів. Методи видалення і старіння були раніше опісанних38.

1. Прорізати перешийок Гілл і зігнути голову назад. Смуги від м'язової та сполучної тканини навколо нижньої частини округлий знайти prootic булли, підняв кістляві області.
2. Оцінка або вирізати з кісток різців і тріщини піддавати отоліти. Їх можна побачити неозброєним оком.
3. Місце отоліти в маркованих флакона або монета конверт і зберігати при кімнатній температурі до тих пір, поки аналізуються для віку шляхом підрахунку кільця або пріращеній38. Якщо розміщення в флаконі, відкрийте кришку, коли повернувся в лабораторію і дозволяють ретельно висушіть перед зберіганням.

Малюнок 5: Видалення отоліти. (A) ріжеться перешийка і сполучної тканини і м'язи витягуються геть піддавати основи хребта і neurospinal області. (B) кістки тріщини піддавати отоліти. (C) Lapillar отоліти видаляються. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

5. отримати тканини для аналізів імунну функцію

Примітка: Передньої нирок основних гемопоетичних органу, джерело з лімфоцитів і макрофагів функціональних аналізів і повинні бути видалені асептически, якщо буде культивованих клітин для функціональних аналізів, наприклад mitogenesis, фагоцитарної і вбивство здатності макрофагі39,40.

1. Спрей зовнішньої поверхні риби з 70% етиловому спирті. Використовуйте стерильними ножицями, скальпель і щипці для відкриття черевної порожнини і видалення передньої ниркової тканини, яка темно червоний орган, розташований попереду плавальний міхур.
2. Помістіть зразок передньої нирок в засобах масової інформації (наприклад, Лейбовіц L-15) щоб зберегти клітини живих. Однорідний нирок зразки з подрібнювачем стерильні ручних тканин (наприклад, Tenbroeck тканини м'ясорубку) в одну клітинку суспензій. Тримайте на мокрий лід, поки не повернувся в лабораторію.

6. зберегти тканини для аналізу нуклеїнових кислот

Примітка: Якщо течією молекулярний аналіз буде проводитися, наприклад експресії генів за допомогою Стенограма ізобіліе41 або кількісного PCR42 (полімеразна ланцюгова реакція), помістіть шматочки тканини слід оцінювати у відповідній консервант (наприклад, RNAlater стабілізації рішення) якомога швидше.

1. Для збереження РНК місце два-три маленьких (2 - 3 мм) штук до відповідних консерванту в співвідношенні 10: 1 консервант обсягу тканин.
   Примітка: Зразки повинні бути захищені від сонячного світла або надлишкового тепла і перевозяться на мокрий лід.
2. Для збереження ДНК місце два-три невеликі шматочки тканини в 95% етанолі (10: 1 етанолу тканини за обсягом). Потім, утримуючи зразки на мокрий лід і потім зберігати при температурі від-20 ° C.