Спосіб кількісного визначення РНК вірусу гепатиту с в сироватці крові

Винахід відноситься до медицини, а саме до методів визначення кількості вірусних геномів, присутніх в зразку крові. Розроблено кількісний стандарт для оцінки кількості геномів вірусу гепатиту С в зразку сироватки крові хворих. Розроблено спосіб кількісної оцінки РНК вірусу гепатиту С в сироватці крові з використанням в якості внутрішнього стандарту ретровирусного вектора, що містить модифіковану послідовність вірусу гепатиту С, яка використовується для ампліфікації в ПЛР, і селективний маркер. Пропонований ретровірусний стандарт отримують з культури пакующіх клітин, просто збираючи середу культивування, в якій росли клітини. Технічний результат: наявність у векторі гена стійкості до пуромицин дозволяє визначати титр вірусних частинок стандарту в експериментах по інфікування клітинних культур. Отримувані вірусні частинки стандарту не патогенні для людини і тварин. 1 мул.

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до методів визначення кількості вірусних геномів, присутніх в зразку крові. Нами розроблений кількісний стандарт для оцінки кількості геномів гепатиту С в зразку сироватки крові хворих.

Сьогодні для кількісної оцінки змісту вірусних нуклеїнових кислот застосовується конкурентний ПЛР з використанням стандарту. Внутрішній стандарт ДНК або РНК амплідіфіціруется з тими ж праймерами, що і ДНК або РНК-мішень, але включає або делецию, або вставку, так що продукти, отримані при ампліфікації стандарту і мішені, відрізняються. Змінюються відомі кількості внутрішнього стандарту додаються до рівних аліквотах зразка, що містить невідомі кількості мішені. Внутрішній стандарт і мішень конкурують в рівній мірі за зв'язування з праймерами і ампліфікацію в ПЛР. Ефективність аплікації в даному випадку буде однаковою для двох матриць. Рівні кількості продуктів будуть ампліфікувати в тому випадку, коли початкові концентрації матриць рівні. Ставлення напрацьованих в процесі ПЛР продуктів може бути визначено експериментально і еквівалентна точка може бути обчислена. Найвдаліша на наш погляд модифікація способу вимірювання кількості вірусних нуклеїнових кислот з використанням в якості внутрішнього стандарту мутантних вірусів описана авторами Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman; Norman P, Potomas, MD. Patent US 77661. Спосіб, запропонований Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman; Norman P, Potomas, MD. Авторами запропонований спосіб вимірювання вірусних нуклеїнових кислот в будь-якому зразку з використанням в якості внутрішнього контролю інфекційного мутантного вірусу, який має послідовність-мітку в районі генома, що використовується для ампліфікації. Розведення цього вірусу додаються до рівних аліквотах зразка для вимірювання. Нуклеїнові кислоти виділяються, амплифицируют і визначаються кількісно. Цей спосіб дозволяє уникнути помилок, що виникають при виділенні нуклеїнових кислот. У пропонованому нами винахід на відміну від прототипу внутрішній стандарт сконструйований на основі ретровирусного вектора, в який клонований модифікований ділянку генома вірусу гепатиту С, який використовується для ампліфікації, що дає нам такі переваги: ​​наявність у векторі гена стійкості до пуромицин дозволяє визначати титр вірусних частинок стандарту в експериментах по інфікування клітинних культур; препарат дефектного вірусу, яка здатна до реплікації, отримують з культури пакующіх клітин, просто збираючи середу культивування, в якій росли клітини; одержувані вірусні частинки стандарту не патогенні для людини і тварин. Опис запропонованого способу кількісного визначення РНК вірусу гепатиту С в сироватках крові хворих. Конструювання внутрішнього стандарту. У ретровірусний вектор hBabe в сайт EcoRl вставлена ​​послідовність, що містить модифікований фрагмент кДНК вірусу гепатиту С (1100 н.п.), який використовується для ампліфікації в ПЛР з тими ж праймерами, що і вихідний фрагмент вірусу гепатиту С. Модифікований фрагмент кДНК вірусу гепатиту С має вставку 628 н.п. в положенні 340 н.р. (Крnl). Отримана конструкція (ДНК-матриця) була трансфектірована в мишачу пакующую лінію PG 13 методом електропорації. Клітинна лінія PG 13 культивувалася в середовищі DMEM з 10% FBS. Після селекції на середовищі, що містить 4 мкг / мл пуромицина, проводилося клонування методом лімітують розведень і відібраний клон. Культуральная середовищ цього клону, що містить упаковану в вірусні частинки РНК-матрицю, була зібрана, розлита по аліквотах, заморожена при -70oС і використовувалася для проведення реакції зворотної транскрипції і ПЛР. Праймери. Для проведення зворотної транскрипції і ПЛР використовували праймери (2): SU1 5 '(GTG CTT GCG AGT GC 3' ASU1 5 '(AGG GGTR TCG ATG AC 3' SU2 5 '(GGA GGT CTC GTA GAC CGT G 3' AS1b 5 ' (GAG CCA TCC TGC CCA CCC CA 3 'AS2a 5'CCA AGA GGG ACG GGA FCC TC 3' AS1a 5 '(GGG ATA GGC TGA CGT CTA CC 3' AS3a 5 '(ACC GTT CAG AAG TTT TAC GC 3' (G / A) = R Виділення РНК
Сироватки крові, що містить вірус гепатиту С, зберігаються при -70oС. Аліквоти (25 мкл) серійних розведень супернатанта були додані до 25 мкл сироватки крові і лизировать 450 мкл розчину 5,5 М гуанидин ізоціоціанат, 0,3 М натрій ацетат, об / об фенол, насичений 0,1 М Тріс. РН 6,5Б транспортна РНК, 25 мкг / мл. РНК висаджувалася додаванням рівного об'єму изопропанола. Після центрифугування осад відмивали 70% етанолом і розчиняли в 25 мкл деионизованной води. Зворотній транскрипція
Збирають робочу суміш і інкубують 1 годину при 42oС. 5 мкл розчину РНК
5 мкл 5 RT буфер (250 mMTris, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)
2,5 мкл 2 mM dNTR
2,5 мкл 1 мкМ праймер ASU1
2,5 мкл 50 mM DTT
5 од. RNAsе інгібітор
10 од. М-МLV зворотна транскриптаза
деіонізованной вода до 25 мкл. ПЛР. Готують робочу суміш для поставки двоетапної полімеразної ланцюгової реакції. 1 етап. 2,5 мкл 10 буфер (100 mMTris, pH 8.3, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40% формамід
2,5 мкл 2 mM dNTR
2,5 мкл 1 мкМ праймер SU1, ASU1
5 од. TAQ полімераза
деіонізованной вода до 25 мкл. 1 етап реакції ампліфікації проводять в програмованому термостаті при наступному температурному режимі:
94oС - 30 з
42oС - 60 з
72oС - 45 з
25 циклів
2 етап. 2,5 мкл 10 буфер (100 mMTris, pH 8.3, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40% формамід
2,5 мкл 2 mM dNTR
2,5 мкл 1 мкМ праймер SU2, AS1a, AS1b, AS2a, AS3a
5 од. TAQ полімераза
деіонізованной вода до 25 мкл. 2 етап реакції ампліфікації проводять в програмованому термостаті при наступному температурному режимі:
94oС - 30 з
58oС - 60 з
72oС - 45 з
25 циклів
Аналіз ПЛР-продуктів проводився за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, що містить бромистий етидій. Визначення титру вірусних частинок. До переваг пропонованого внутрішнього стандарту відноситься можливість оцінки титру вірусних частинок в супернатанті за кількістю колоній, які виросли після інфікування клітинної культури на селективної середовищі, так як ретровірусний вектор рBabe забезпечує трансформованим клітинам стійкість до пуромицин. Ретровірусний препарат отримують з культури пакующіх клітин просто збираючи середу культивування, в якій росли клітини. Клітинні уламки видаляють центрифугуванням. Інфіковані клітини вивільняють вірусні частки найбільш активно в експоненційної фазі росту. Максимальний вміст вірусу в середовищі досягається на стадії, безпосередньо попередньої формуванню злитого моношару. Коли моношар сформувався на 80-90%, клітини поміщають в свіжу середу і інкубують ще 12-24 години, після чого збирають вірус. Інфікування клітин-мішеней. 1. Клітини висіваються в кількості 400000 на: см-чашки за один день до інфікування. Кількість чашею визначається числом передбачуваних розведень вірусного препарату. 2. З чашок видаляється культуральная середовище та заливається 2 мл свіжої середовища, що містить певну кількість вірусу і 8 мкг / мл полібрена. 3. Чашка поміщається в інкубатор на 2 години. 4. З чашок видаляється середовище, що містить полібрен, і наливається 5 мл свіжої середовища. Клітини залишаються при 37oС до розсівання на 24 години. 5. Клітини поміщаються в середу, що містить пуромицин. 6. Після 7-10 днів селекції підраховують кількість пуроміцінустойчівих колоній, що виникли в результаті інфекції. Титр препарату визначають як кількість колонієутворюючих одиниць в 1 мл вірусної суспензії. Одержуваний цим методом титр вірусних частинок в супернананте відповідав 1000000 / мл. Приклад визначення кількості РНК вірусу гепатиту С в сироватці хворого наведено на кресленні. Продукти ампліфікації фрагмента РНК вірусу гепатиту С і внутрішнього стандарту мають розміри 315 н.п. і 943 н.п. відповідно. Доріжка 2: кількості продуктів ампліфікації двох матриць рівні (див. Креслення). Виходячи з цього, кількість РНК вірусу гепатиту С в сироватці даного хворого одно 20000 копій / мл. Список літератури
1. Natarajan; Venkatachala, Germantown, MD Salzman, Norman P.Potomas, MD. Internflly controlled virion nucleic acid amplification reaction for quantitation of virion nucleic acid. US Patent US 6077661 (2000). 2. Сударіков А. Б., огрів О.Д., Спосіб виявлення вірусу гепатиту С в сироватці крові людини. Патент РФ 2150505 (2000).

формула винаходу

Спосіб оцінки кількості РНК вірусу гепатиту С в сироватці крові методом ПЛР з використанням внутрішнього стандарту, що відрізняється тим, що в якості внутрішнього стандарту використовували ретровірусних частки, отримані на основі ретровирусного вектора рBabe, в сайт EcoRl якого вставили послідовність, що містить модифікований фрагмент кДНК вірусу гепатиту С (1100 н. п.), що має вставку 628 н. п. в положенні 340 н. п. (Крnl), після чого отриману ДНК-матрицю трансфектіровалі методом електропорації в мишачу пакующую лінію PG13 і культивували, потім в середовищі, що містить пуромицин, відбирали клон, культивували його, культуральне середовище, що містить РНК-матрицю, упаковану в вірусні частинки, збирали і використовували для обчислення титру вірусних частинок стандарту після інфікування сприйнятливих клітин-мішеней серійними розведеннями вірусу.

МАЛЮНКИ