Тема 7. Використання в вірусології курячих ембріонів

ознайомити студентів з методами відбору курячих ембріонів для культивування вірусів.
Устаткування і матеріали: курячі ембріони 9-12 денного віку інкубації, овоскоп, спиртові тампони, підставки для ембріонів, пінцети, ножиці, лейкопластир, голки, шприци, прості олівці, пробійники, голочки , Таблиці, схеми, мультимедійне обладнання, презентації MS Office Power Point по темі заняття.
Методика проведення заняття та методичні вказівки по темі.
Пояснення викладача. Культивування вірусів на курячих ембріонах найбільш доступний і зручний метод для первинного виділення вірусу. Практика застосування цього методу зараження показала ряд переваг перед іншими методами. Для зараження використовують ембріони 5-12 денний інкубації.
7.1 Переваги і недоліки курячих ембріонів як біологічних об'єктів. Культивування вірусів в курячих ембріонах - найбільш доступний і зручний метод як для первинного виділення вірусів від хворих тварин і з об'єктів зовнішнього середовища, так і для подальшого культивування вірусів в лабораторії. Цей метод широко застосовується для ідентифікації вірусів і антитіл, а також для приготування вакцин і діагностикумів. Практика застосування показала ряд переваг цього методу перед культивуванням вірусів на лабораторних тваринах. Відомо, що білі миші, яких широко використовують при вірусологічних дослідженнях , Можуть бути спонтанно заражені поруч вірусних інфекцій: ектромеліей, лімфоцитарним хоріоменінгітом, енцефалітом Тейлора, вірусною пневмонією, вірусом Сендай і іншими, що вкрай ускладнює роботу і нерідко призводить до помилкових висновків при оцінці отриманих результатів. Культивування вірусів на курячих ембріонах значною мірою усуває зазначені вище труднощі. Поряд з цим від курячого ембріона можна отримати значно більшу кількість вірусу, ніж від лабораторних тварин. Курячий ембріон має більшу життєздатність і стійкістю до різного роду впливів, неминучим при введенні досліджуваного матеріалу. При відомій навичці роботи з ембріонами і дотриманні правил асептики загибель їх незначна. Найбільший відхід ембріонів буває при введенні матеріалу в амніотичну порожнину і жовтковий мішок, а й в цих випадках вона не перевищує 10-15%, якщо дотримані необхідні умови інкубування.

Курячі ембріони як жива система увійшли в вірусологічну практику в 30-х роках XX ст. Їх використання розширило спектр культивованих в лабораторних умовах вірусів, дозволило більш успішно вирішувати поставлені перед вірусологією завдання в зв'язку з тим, що курячі ембріони мають ряд переваг перед лабораторними тваринами: 1) шкаралупа і подскорлупная оболонка надійно захищають ембріон від бактеріального зараження з боку зовнішнього середовища; 2) важливою перевагою ембріонів є також їх висока чутливість до широкого спектру вірусів, що пояснюється недостатнім розвитком захисних механізмів; 3) курячі ембріони легкодоступний об'єкт в зв'язку з розвитком широкої мережі птахофабрик і інкубаторіїв; 4) курячі ембріони економічні, не вимагають догляду та годування.

Основними недоліками є: 1) неможливість повністю гарантувати стерильність цієї живої системи , Так як ембріони можуть нести в своєму вмісті віруси і інші патогенні агенти (віруси інфекційного бронхіту курей, ньюкаслської хвороби, грипу, лейкозу, хламідії і мікоплазми). Їх присутність може спотворювати результати дослідження; 2) курячі ембріони чутливі не до всіх вірусів.
7.2 Цілі використання курячих ембріонів. Використовують курячі ембріони в вірусології в основному для тих же цілей, що і лабораторних тварин, а саме:

- виявлення в патматеріалі активного вірусу біопроб;

- первинного виділення вірусу. Ефективно виділяють і культивують на курячих ембріонах віруси, що викликають захворювання у птахів, а також деякі віруси ссавців;

- підтримки вірусів в лабораторії;

- титрування вірусів;

- накопичення вірусу для лабораторних досліджень і отримання вакцин;

- як тест-об'єкт в реакції нейтралізації.
7.3 Вимоги до курячим ембріонам. Яйця необхідно отримувати з благополучних по вірусних хвороб господарств. У запліднених яйцях навіть від клінічно здорових курей можуть перебувати різні зустрічаються у цих птахів віруси: ньюкаслської хвороби, інфекційного бронхіту , Інфекційного ларинготрахеїту, енцефаломієліту, парагрипу-2, поліартриту, віспи, арбовіруси, аденовіруси та ін. Присутність цих вірусів може, з одного боку, призвести до діагностичних помилок, а з іншого, на основі явища інтерференції, - до придушення розмноження вірусу, що знаходиться в досліджуваній пробі. Ембріони, що не містять вірусу, але отримані від курей, безсимптомно заражених певними вірусами, також можуть бути менш чутливі або абсолютно нечутливі до дії даного вірусу завдяки наявності специфічних антитіл, отриманих від матері з жовтком. для вдалого виділення вірусу необхідно , Щоб кури, ембріони яких використовують в роботі, не були вакциновані проти хвороби, збудника якої шукають. Шкаралупа яєць повинна бути непігментованою, чистої (мити не можна). Вік ембріона повинен відповідати обраному методу зараження.

Для забезпечення нормального розвитку зародків в запліднених яйцях в період інкубації необхідно дотримуватися певну температуру і вологість. Країни, що розвиваються ембріони переносять перегрів значно гірше, ніж охолодження. Тому короткочасна (протягом декількох годин) поломка в системі обігріву не приносить великої шкоди. При більш тривалому перерві необхідний підігрів.

Інкубіруемой яйця потребують вільному доступі свіжого повітря, що надходить через віддушини. Вони повинні бути завжди відкритими. Одне яйце, як прийнято вважати, витрачає 1 л кисню в день, що не дивно, якщо згадати про бурхливий розвиток зародка протягом 21 дня інкубації. Саме тому яйця не можна класти впритул, а також одне на інше. Для інкубації яєць непридатні звичайні термостати. Лише в разі крайньої необхідності їх можна використовувати для цих цілей, але при цьому часто провітрювати і поставити всередину посудину з водою для забезпечення необхідної вологості.

Закладені на інкубацію яйця через 3-5 днів просвічують за допомогою спеціальної настільної або ручний (якщо яйця не виймають з лотка інкубатора) лампи, щоб відібрати незапліднені. Найбільш зручні для вірусологічних робіт яйця леггорнів, так як їх тонка біла шкаралупа дозволяє краще розглянути вміст. Незапліднені або містять загиблих зародків яйця з інкубатора видаляють. Частка запліднених яєць коливається в значних межах в Залежно від багатьох чинників , В тому числі від пори року: навесні вона найвища, взимку найнижча.

Другий раз зародки просвічують в день запланованого зараження. Термін цей залежить від виду вірусу, а також шляхи його введення. На шкаралупі звичайним (НЕ чорнильним) олівцем відзначають місце зараження.
7.4 Будова курячого ембріона. Зазвичай курка відкладає запліднене яйце, в якому зародок знаходиться на стадії бластули або ранньої гаструли. При нагріванні яйця до температури, близької до температури тіла курки, відбувається подальший розвиток зародка (рис. 14). У період з 5-го по 12-й день інкубації курячі ембріони можуть бути використані для зараження вірусами.

Малюнок 14.Схематіческій розріз курячого ембріона на 8-й день інкубації: 1 - шкаралупа; 2 - подскорлупная оболонка; 3 - хоріоналлантоісной оболонка; 4 - аллантоісная порожнину; 5 - жовтковий мішок; 6 - білок; 7 - повітряна камера; 8 - тіло зародка; 9 - амніотична порожнина

Яйце з розвиваються курячим ембріоном покрито зовні твердої пористої шкаралупою , До якої щільно прилягає подскорлупная оболонка. Остання в тупому кінці яйця розділяється на два листки, між якими утворюється повітряна камера. Тіло зародка лежить в яйці ексцентрично, спиною ближче до шкаралупи, голова спрямована в бік повітряної камери. Зародок занурений в навколоплідної рідини, що заповнює амніотичну порожнину, і пуповиною пов'язаний з жовтком. Жовток також розташовується ексцентрично і щодо зародка як би по інший бік поздовжньої осі.

Безпосередньо під подскорлупной оболонкою знаходиться аллантоісная порожнину, що покриває амнион і жовтковий мішок, а до 10-11-го дня замикається в гострому кінці яйця. В процесі розвитку аллантоісная оболонка зростається з хорионом, утворюючи єдину хоріоналлантоісной оболонку (ХАО). У гострому кінці яйця знаходиться залишок білка.

Зараження в ту або іншу частину ембріона проводиться в період її максимального розвитку, коли кількість чутливих клітин буде найбільшим.

В процесі інкубації змінюються розміри зародкових структур, що багато в чому пояснюється їх функціональним призначенням і визначає оптимальний для зараження вік ембріона.

Так, жовтковий мішок як резервуар поживних речовин має найбільший обсяг на початку інкубації, а потім (після 12-го дня) у міру розвитку зародка він зменшується. Заражають в жовтковий мішок з 5-го по 7-й день інкубації.

Амніотична порожнина, будучи буферної середовищем розвитку зародка, покриває його вже на 5-й день інкубації. Середня кількість рідини до середини періоду інкубації становить близько 1 мл.

Для зараження в амніотичну порожнину використовують ембріони в віці 6-10 днів.

Аллантоісная порожнину служить для збору продуктів обміну, в ній скупчуються сечокислі солі , Фосфорні і азотисті сполуки. У процесі росту і розвитку зародка аллантоісная рідина набуває кислу реакцію. Максимальних розмірів аллантоісная порожнину досягає на 9-12-й день розвитку ембріона, тому зараження в аллантоісную порожнину проводять переважно на 9-11-й день інкубації.

Хоріоналлантоісной оболонка багата кровоносними судинами, які, тісно прилягаючи до внутрішньої поверхні пористої шкаралупи, насичуються киснем і постачають їм тіло зародка, виконуючи функцію органу дихання ембріона. Максимального розвитку ХАО досягає на 11-13-й день. Зараження на хоріоналлантоісной оболонку проводять на 10-12-й день інкубації.

Ембріони доставляють з інкубаторію, не допускаючи їх охолодження в дорозі. У лабораторії ембріони інкубують в термостаті при температурі 37 ° С і вологості 60-70%, що досягається встановленням в термостаті відкритих широкогорлих ємностей з рідиною. Вентиляційні отвори термостата повинні бути відкриті. Ембріони розміщують повітряною камерою вгору в спеціальних штативах. Рекомендується до моменту зараження дати можливість ембріонам протягом доби адаптуватися до нових умов і нормалізувати свої функції після транспортного стресу. Якщо лабораторія має власний інкубаторієм, то знесені куркою запліднені яйця придатні для закладки в нього протягом 10 днів.

Підготовка курячих ембріонів до зараження включає овоскопирования і дезінфекцію шкаралупи, а також відповідну підготовку робочого місця. Овоскопирования є перегляд яєць проти досить яскравого джерела світла (овоскоп), в результаті чого на неосвітленій стороні шкаралупи утворюються тіні від внутрішніх структур (рис. 15). Овоскопирования проводять в затемненому приміщенні. При цьому на шкаралупі графітним олівцем відзначають кордон повітряної камери, місце розташування зародка і ділянку безсудинних зони розміром 0,5x0,5 см. Ці позначки служать орієнтиром при виборі місця введення віруссодержащего матеріалу. При овоскопирования також визначають, чи живий зародок або загинув. Зародків, які виявляють активні рухи при хорошій кровонаповнення судин ХАО, вважають живими.

Курячі ембріони заражають в асептичних умовах (краще в боксі). У передбокснику шкаралупу ембріонів обробляють йодованим спиртом, потім вже в боксі повторно протирають, а іноді ще й фламбіруйте - обробляють полум'ям змоченого спиртом тампона.

Ембріони фіксують в спеціальних підставках, встановлених в емальованому кюветі на 3-4-шарової марлевій серветці, змоченою дезинфікуючим розчином.

У роботі використовують інструменти, стерилізовані кип'ятінням. Їх ставлять в баночку зі спиртом і обпалюють полум'ям пальника перед кожним повторним використанням.

Демонстрація:

а) клінічних ознак захворювання у заражених лабораторних тварин; б) методів умертвіння лабораторних тварин; в) техніки розтину (звертають увагу студентів на стан внутрішніх органів) і прийомів отримання віруссодержащего матеріалу; г) техніки виготовлення відбитків мозку; д) дій щодо знезараження робочого місця і трупа після розтину зараженої тварини.
Самостійна робота студентів: а) розпізнавання по кольоровий мітці заражених кожним зі студентів мишей, аналіз їх клінічного стану, умертвіння, фіксація в кюветі з восковим (парафіновим) дном, розтин ; б) аналіз патологоанатомічних змін, отримання віруссодержащего матеріалу (паренхіматозних органів), приготування пошарових відбитків мозку
завдання

1.Изучить будова курячого ембріона.

2.Провести овоскопі курячого ембріона, визначити його життєздатність і відзначити кордону тіней природних утворень.

3. Підготувати курячі ембріони до зараження.

Студенти проводять овоскопі курячого ембріона, визначають його життєздатність і відзначають кордону тіней природних утворень.

Підведення підсумків заняття
Завдання на наступне заняття
Контрольні питання:

1. Будова курячого ембріона.

2. Для чого використовують курячі ембріони в вірусології?

3. Яка будова розвивається курячого ембріона?

Тема 8.Використання в вірусології курячих ембріонів.Зараження курячих ембріонів
Мета заняття:

ознайомити студентів з методами зараження курячих ембріонів для культивування вірусів.
Устаткування і матеріали: курячі ембріони 9-12 денного віку інкубації, овоскоп, спиртові тампони, підставки для ембріонів, пінцети, ножиці, лейкопластир, голки, шприци, прості олівці, пробійники, голочки, таблиці, схеми, мультимедійне обладнання, презентації MS Office Power Point по темі заняття.
Методика проведення заняття та методичні вказівки по темі.
Пояснення викладача. Суттєво впливає на розмноження вірусів в ембріонах метод зараження. Перед зараженням інкубовані яйця просвічують, загиблі відокремлюють. На шкаралупі яєць з живими ембріонами, які розрізняють по червоному кольору кровоносних судин і руху ембріона, олівцем відзначають місце зараження.
8.1 Методи експериментального зараження курячих ембріонів.

Заражають ембріони в стерильному боксі, що має робочий стіл, два табурети, підведення газу, водопровід і вакуум. Зараження в амніотичну порожнину проводять в затемненій кімнаті. Робоче місце повинно бути добре освітлене. Перед роботою стіл дезінфікують. Для дезінфекції поверхні яєць готують антисептичний розчин (70% -ний спирт, 2% -ний розчин йоду) і обгорнуту ватою дерев'яну паличку, зігнутий зубної зонд або бормашину для просвердлювання яєчної шкаралупи. Яйця заражають за допомогою стерильних шприца для туберкулинизации і спеціальних голок. Місце зараження на яйці заливають парафіном. Для цього готують парафінові палички: в пробірку, заповнену розплавленим парафіном, вводять скляну паличку, стежачи за тим, щоб вона перебувала в центрі пробірки до остигання парафіну.

Коли парафінова паличка знадобиться, стінки пробірки нагрівають на пальнику і за скляну паличку витягують парафін з пробірки. Потримавши паличку над полум'ям , Розплавляють необхідне для закриття отвору в яйці кількість парафіну. Цей спосіб дуже чистий, і при ньому не утворюються пари парафіну.

Крім того, на робочому столі в боксі розміщують стакан із стерильними ватними тампонами, стакан з 3% розчином їдкого натру для використаних інструментів і посудину з розчином хлораміну для використаних скляних предметів. У разі потреби можна приготувати підставку для яєць, невелику емальовану чашку і стерильні живильні середовища. Підготовлений таким чином робочий стіл протягом 1-2 ч піддають УФ-опромінення.

З огляду на патогенність досліджуваних вірусів, роботи ведуть в масці, гумових рукавичках і захисних окулярах.

Існує Шість методів зараження ембріонів. Найбільш часто використовують зараження в аллантоісную порожнину і на хоріоналлантоісной оболонку, рідше - в амніотичну порожнину і в жовтковий мішечок і зовсім рідко - в тіло зародка і в кровоносні судини ХАО. Вибір методу визначається тропизмом вірусу, а також метою зараження. При будь-якому методі зараження вводять 0,1-0,2 мл інфекційного матеріалу.

При зараженні цим методом добре розмножуються віруси грипу, ньюкаслської хвороби, ринопневмонії коней, везикулярного стоматиту та ін. Існує кілька варіантів методу.
Перший варіант. Ембріон фіксують вертикально тупим кінцем вгору. У шкаралупі на стороні зародка, а іноді з протилежного зародку боку на 5-6 мм вище кордону повітряної камери роблять отвір діаметром близько 1 мм. Голку вводять паралельно поздовжньої осі на глибину 10-12 мм (рис. 16). Після ін'єкції віруссодержащего матеріалу голку витягують, а отвір в шкаралупі закривають краплею розплавленого стерильного парафіну.

Малюнок 16. Зараження в аллантоісную порожнину (перший варіант) (по Ніколау)
Другий варіант. Зроблене в шкаралупі над повітряною камерою отвір використовують лише для виходу частини повітря. Отвір ж для самого зараження роблять на ділянці безсудинних зони хоріоналлантоісной оболонки (ХАО) з боку зародка. Голку вводять на глибину не більше 2-3 мм. Ін'єктують інфікується рідина в обсязі 0,1-0,2 мл і закривають отвір парафіном (див. Рис. 17).
8.1.2 Зараження на хоріоналлантоісной оболонку. Цей метод зараження курячих ембріонів частіше використовують для культивування епітеліотропним і пантропних вірусів віспи, інфекційного ларинготрахеита птахів , Чуми м'ясоїдних, хвороби Ауєскі, катаральної лихоманки овець і ін.

Таке зараження може бути виконано через природну або штучну повітряну камеру.

Для зараження через природну повітряну камеру ембріон поміщають в штатив вертикально тупим кінцем вгору і в шкаралупі проти центру повітряної камери вирізують круглий вікно діаметром 15-20 мм. Через це вікно пінцетом знімають подскорлупную оболонку. На оголився ділянку ХАО наносять 0,2 мм віруссодержащей суспензії (рис. 18), отвір закривають лейкопластирем або рідше покривним склом, зміцнивши його розплавленим парафіном.

Зараження через штучну повітряну камеру застосовують частіше першого, так як воно забезпечує контакт віруссодержащего матеріалу з більшою поверхнею ХАО і, отже, веде до утворення більшої кількості вірусу.

Для зараження ембріона цим методом його поміщають в штатив горизонтально зародком вгору. У шкаралупі роблять два отвори: одне невелике над центром повітряної камери (призначене для відсмоктування з неї повітря), а інше діаметром 0,2-0,5 см збоку, з боку зародка. Складність методу в тому, що, роблячи другий отвір, необхідно обережно зняти спочатку шматочок шкаралупи, потім ковзаючим рухом , Не пошкоджуючи ХАО, зрушити подскорлупную оболонку в сторону так, щоб через дефект, що міг пройти повітря. Після цього гумовою грушею через перший отвір відсмоктують повітря з природною повітряної камери (рис. 19, а) .В результаті через бічний отвір зовнішнє повітря спрямовується всередину, утворюючи штучну повітряну камеру, дном якої є ХАО (рис. 19, б).

Через бічний отвір на поверхню ХАО наносять інфекційну рідина і отвір закривають шматочком лейкопластиру. Закривати перший отвір немає необхідності, так як внутрішній листок подскорлупной оболонки при цьому методі зараження не порушується і продовжує виконувати роль бар'єра для мікрофлори навколишнього середовища.

Подальшу інкубацію ембріонів, заражених цим методом, проводять в горизонтальному положенні боковим отвором вгору.
8.1.3 Зараження в жовтковий мішок. Здебільшого ним користуються для розмноження хламідій, а також вірусів хвороби Марека, ринопневмонії коней, катаральної лихоманки овець і ін. Заражають ембріони 5-7-денного, а іноді і 2-3-денного віку (вірус лихоманки долини РІФ). Використовують два варіанти зараження.
Перший варіант. Ембріони поміщають в штатив у вертикальному положенні. Роблять отвір в шкаралупі над центром повітряної камери і вводять голку на глибину 3,5-4 см під кутом 45 ° до вертикальної осі в напрямку, протилежному місцем знаходження зародка (рис. 20).

Малюнок 20. Зараження курячого ембріона в жовтковий мішок (по Ніколау та ін.)
Другий варіант. Іноді аналогічний шлях зараження здійснюється на горизонтально укріпленому в штативі ембріоні; при цьому зародок знаходиться внизу, а жовток-над ним. Отвір в шкаралупі закривають краплею розплавленого парафіну.
8.1.4 Зараження в амніотичну порожнину. Для цієї мети використовують ембріони 6-10-денного віку. Метод використовується при культивуванні вірусів грипу , Ньюкаслської хвороби, ринопневмонії коней та ін. Є два способи зараження.
Закритий спосіб. Зараження проводять в затемненому боксі. Яйце поміщають на овоскопі в горизонтальному положенні зародком вгору. Через отвір в шкаралупі над повітряною камерою вводять голку з затупленим кінцем у напрямку до зародку. Доказом того, що голка проникла в амніон, служить рух тіла зародка в напрямку пересування.
Відкритий спосіб. Шкаралупу над повітряною камерою зрізають так, щоб утворилося вікно діаметром 1,5-2,5 см. Через нього пінцетом під контролем очі знімають подскорлупную оболонку. Потім анатомічний (14 см) пінцет з зімкнутими браншамі ведуть, продавлюючи хоріоналлантоісной оболонку у напрямку до зародку. Коли пінцет досягне його, бранши розмикають, захоплюють амниотическую оболонку разом з ХАО і підтягують до вікна. Утримуючи лівою рукою пінцет з фіксованою в ньому оболонкою амниона, вводять віруссодержащего матеріал (рис. 21). Далі все оболонки опускають, вікно закривають лейкопластирем і ембріон инкубируют в вертикальному положенні.

Малюнок 21. Зараження курячого ембріона в амніон відкритим способом (по Ніколау та ін.)

8.1.5 Зараження в кровоносні судини ХАО. При овоскопирования 11- 13-денних ембріонів відзначають великий кровоносну судину. За його ходу видаляють ділянку шкаралупи, наносять 1-2 краплі спирту, що робить на деякий час подскорлупную оболонку прозорою. Під контролем очі на овоскопі голку вводять в посудину, що підтверджується його рухливістю при невеликих бічних рухах голки. Голу ділянку подскорлупной оболонки закривають шматочком лейкопластиру.

Можна матеріал в судини ввести і кілька відрізняється способом: зрізають шкаралупу над повітряною камерою, подскорлупную оболонку змочують спиртом і в що стали помітними судини ХАО вводять матеріал. Отвір закривають шматочком стерильного лейкопластиру.

Описані технічні прийоми експериментального зараження курячих ембріонів не єдині , А мають різні варіанти.

Для зараження використовують ембріони 7-12-денного віку. Відомо два варіанти методу.
Перший варіант. Заражають так само, як в амніон закритим способом, з тією лише різницею, що беруть гостру голку і на овоскопі показником попадання голки в тіло вважають підпорядкування зародка рухам голки.
Другий варіант. Заражають так само, як в амніон відкритим способом: через вікно в шкаралупі підтягують пінцетом тіло зародка. Матеріал вводять в головний мозок або певні ділянки тіла. При таких методах зараження буває значний відсоток неспецифічної загибелі ембріонів.
8.2 Накопичення вірусу в курячому ембріоні. Перед подальшої инкубацией на шкаралупі заражених будь-яким методом курячих ембріонів простим (графітним) олівцем пишуть, ніж заражений ембріон і коли, а якщо потрібно, то і інші відомості. Заражені курячі ембріони поміщають в термостат для подальшої інкубації, в процесі якої відбуваються репродукція внесених вірусів і їх накопичення в відповідних структурах. Температура інкубації ембріонів варіює від 33 до 38 ° С в залежності від властивостей вірусу, яким проведено зараження. За ембріонами ведуть постійне спостереження, переглядають на овоскопі, відбираючи полеглі. Загибель ембріонів в перші 24 години після зараження найчастіше обумовлена ​​розмноженням грибів, бактеріальної мікрофлори, внесених в ембріон разом з інокуляти, або травмуванням при зараженні. Ця загибель вважається неспецифічної. У більш пізні терміни ембріони гинуть в результаті, як правило , Розмноження в ембріонах вірусу. Виявивши загиблі ембріони, їх відразу ж переносять в холодильник з температурою 4 ° С. Такі умови, з одного боку, сприяють збереженню активності накопичився в ембріоні вірусу, з іншого - ущільнення тканин і запустіння судин, що значно полегшує подальше розтин.

Ембріони інкубують до моменту максимального накопичення вірусу. Для кожного вірусу і навіть штаму цей термін є певним і варіює в межах від 2 до 7-8 діб. Так, для вірусу ньюкаслської хвороби штаму Н він становить 2-3 дня, для того ж вірусу штаму В, - 5 днів, для вірусу інфекційного ларинготрахеїту птахів - 5 днів і т. Д. Потім все ембріони умертвляють охолодженням при 4 ° С протягом не менше 3-4 ч і розкривають.

основі методу лежить видалення ембріона з яйця в період, коли до його шкаралупі зсередини повністю прилягає хоріоналлантоісной оболонка. Якщо всередину такого яйця додати живильне середовище, то утворюється своєрідна культура тканини, в якій може розмножуватися вірус. Метод має ряд переваг: він дозволяє отримати більш чистий вірус, ніж в аллантоісной-амніотичної рідини, що важливо для зниження аллергизирующих властивостей вакцин, приготованих з цього матеріалу; відсутність жовткового мішка і , Отже, що містяться в ньому специфічних антитіл дозволяє краще розмножуватися деяких вірусів. У деяких випадках цей метод дає хороші результати в діагностичних роботах, так як при ньому можна вводити великі кількості досліджуваного матеріалу, що збільшує можливість виділення вірусу.

Метод запропонував Бернкопф ще в 1949 р, але через труднощі застосування широко не використовується. Труднощі ці пов'язані з властивістю хоріоналлантоісной оболонки в процесі інкубації відділятися від шкаралупи, що знижує цінність культури і ускладнює маніпуляції отримання вірусу і заміни живильного середовища.

Е. Гройель (1963) ввів ряд модифікацій, які дозволили усунути ці труднощі. Він запропонував використовувати 15-денні і навіть більш старі яйця, які в процесі інкубації слід часто перевертати для рівномірного розвитку оболонки на шкаралупі яйця. При просвічуванні позначають кордону повітряної камери. Шкаралупу відпилюють на 0,5 см вище цієї лінії, на край шкаралуп'яну оболонки наливають розплавлений парафін (56-58 С °), який застигаючи, фіксує край яйця. Потім вирізують круглий отвір в оболонці над зародком, залишаючи навколо вузький обідок. Наступний етап - обережне видалення зародка з яйця. При цьому яйце слід утримувати в горизонтальному положенні і повільно повертати. Таким шляхом знаходять судини, що зв'язують ембріон з ХАО, і перерізають їх ножицями. Якщо яйце тримати вертикально, то зародок своєю масою відтягує оболонку, відриваючи її зазвичай в області гострого кінця яйця. Попадання навіть невеликої кількості рідини між ХАО і шкаралупою викликає повну відшарування оболонки протягом 1-2 днів.

Після видалення зародка оболонку, вистилає яйце , Кілька разів промивають фізіологічним розчином, охолодженим до 4-0 ° С, до тих пір, поки рідина не стане прозорою. Потім в порожнину яйця вводять 20 мл живильного середовища, підігрітою до 37 ° С, і яйце закривають стерильним гумовим ковпачком, попередньо зануривши його в парафін. Трубка з гумовою пробкою, вмонтована в яйце, забезпечує як взяття, так і введення рідини без небезпеки бактеріального зараження. Такий біологічний об'єкт зберігає життєздатність протягом декількох днів.

За методикою Йошино і інших, порожнина деембрінірованних яєць заповнюють розчином агару в розчині Хенкса. Заражають деембрінірованние яйця через трубку в ковпачку.
завдання

1. Провести овоскопі курячого ембріона, визначити його життєздатність і відзначити кордону тіней природних утворень.

2. Підготувати курячі ембріони до зараження.

3.Заразіть курячі ембріони вірусами ньюкаслської хвороби та віспи голубів (курей).

Самостійна робота студентів: а) овоскопирования трьох курячих ембріонів; б) дезінфекція цих же курячих ембріонів; в) підготовка робочих місць і спецодягу до зараження ембріонів; г) зараження 9-денного курячого ембріона вірусом ньюкасл-ської хвороби (штам В1ілі Н) в аллантоісную порожнину, підписування його ; д) зараження 11-денного курячого ембріона вірусом віспи голубів (курей) на ХАО через штучну повітряну камеру, підписування його; е) укладання заражених курячих ембріонів і їх розміщення в термостаті для інкубування.

Підведення підсумків заняття
Завдання на наступне заняття
Контрольні питання:

1. Які методи можна використовувати для зараження курячих ембріонів вірусами?

2. Що ви знаєте про методи індикації вірусів у курячих ембріонах?