Віруси, їх природа, походження. Методи культивування вірусів.

КАТЕГОРІЇ:

Автомобілі Астрономія Біологія Географія Будинок і сад Інші мови інше Інформатика Історія Культура література логіка Математика Медицина металургія механіка Освіта Охорона праці Педагогіка політика право Психологія релігія риторика Соціологія Спорт Будівництво технологія туризм фізика Філософія фінанси хімія Креслення Екологія Економіка електроніка

Віруси - дрібні мікроби, які не мають клітинної будови, белоксинтезирующей системи, що містять тільки ДНК або РНК. Відносяться до царства Vira. Будучи облігатними внутрішньоклітинними паразитами, віруси розмножуються в цитоплазмі або ядрі клітини. Вони - автономні генетичні структури. Відрізняються особливим - роз'єднаним (діс'юнктівним) способом розмноження (репродукції): в клітці окремо синтезуються нуклеїнові кислоти вірусів і їх білки, потім відбувається їх збірка в вірусні частинки. Сформована вірусна частка називається вирионом.

Методи культивування вірусів

Оскільки віруси не ростуть на штучних поживних середовищах, а розмножуються тільки внутрішньоклітинно, потрібно було знайти прості і загальнодоступні методи їх культивування. Великим досягненням була пропозиція Р. Гудпасчура в 1932 р використовувати для культивування вірусів курячі ембріони, в клітинах яких успішно розмножуються багато вірусів. Однак остаточне рішення проблеми їх культивування виявилося можливим лише після того, як були розроблені основні способи культивування клітин поза організмом.

Хоча здатність клітин рости поза організмом була встановлена ​​ще в 1907 р, було потрібно багато років для розробки доступних методів культивування клітин, а в них - вірусів. Спочатку був використаний метод переживають тканин. Він полягав у тому, що в колбу, що містить живильне середовище, вносили шматочок тканини. Клітини деяких тканин в таких умовах можуть переживати (але не розмножуватися) до 30 днів, а в них можуть розмножуватися віруси. Однак цей спосіб давав дуже невеликий вихід вірусів. Необхідно було розробити умови, при яких клітини тканини могли б вільно розмножуватися. До початку другої половини XX в. епідемії поліомієліту взяли настільки широкий і небезпечний характер, що було потрібно вжити негайних заходів для створення вакцини, яку можна було б використовувати для масового застосування. Але для цього потрібно було знайти метод, що дозволяє швидко вирощувати віруси у великій кількості. Це і стало однією з обставин, що стимулювали розробку методів культивування вірусів. Для отримання культур клітин, які можна було б використовувати для вирощування вірусів, необхідно було вирішити чотири головні проблеми:

1) отримати в необхідній кількості вільні (т. Е. Ізольовані один від одного) клітини;

2) створити такі поживні середовища та умови, в яких клітини могли б активно розмножуватися;

3) забезпечити умови, при яких в культурах клітин не могли б розмножуватися бактерії;

4) визначити методи, за допомогою яких можна було б розпізнавати зростання вірусу в культурі клітин і ідентифікувати його.

Всі ці проблеми були вирішені. Для виділення ізольованих, але життєздатних клітин із зруйнованих тканин використовували обробку їх слабким розчином трипсину, що руйнує міжклітинні містки. Для культивування клітин були запропоновані різні середовища, що містять всі необхідні для розмноження клітин поживні речовини (амінокислоти, підстави, вітаміни та ін.), Мінеральні солі, які мають оптимальну рН і т. Д. До живильних середовищ додавали індикатор, зі зміни кольору якого можна було судити про метаболізм клітин і їх розмноженні. Було встановлено, що в якості основи, на якій клітини розмножуються і утворюють моношар, може бути використано добре оброблене скло пробірок і колб. Для придушення можливого зростання бактерій віруссодержащего матеріал перед посівом його в культури клітин обробляють антибіотиками. Вирішальне значення мали досліди, проведені в 1949 р Дж. Ендерсом, Т. Веллер і Ф. Роббінс, які показали, що вірус поліомієліту добре розмножується в первинно-трипсінізірована культурах клітин, отриманих з нирок мавп.

Розробка способів отримання культур клітин дозволила широко впровадити в практичну медицину сучасні класичні методи вірусологічної діагностики інфекційних захворювань, з одного боку, і забезпечити накопичення вірусів в кількостях, достатніх для виробництва вакцин, з іншого. Основний недолік первинно-трипсінізірована клітин полягає в тому, що після кількох пересівань вони перестають розмножуватися. Тому перевагою стали користуватися культури таких клітин, які здатні розмножуватися in vitro нескінченно довго. Такі перещеплюваних культури клітин отримують з пухлинних тканин (НеLа, нер-2 та ін.) Або з мутантних клітин з Поліплоїдний набором хромосом. Однак пухлинні клітини не можна застосовувати для отримання вакцин. Для цих цілей використовують тільки культури таких клітин, які не містять ніяких кон- тамінантних вірусів і не володіють злоякісністю. Найкраще цим вимогам відповідають культури диплоїдних клітин. «Штамом диплоїдних клітин називається морфологігескі однорідна культура клітин, стабілізована в процесі культивування in vitro, що має огранігенний термін життя, що характеризується трьома фазами росту (стабілізації, активного росту і старіння), що зберігає в процесі пасирування каріотип, властивий вихідній тканини, вільна від контамінантів і не володіє онкогенної активністю при трансплантації хомячкам »(рішення Симпозіуму з диплоїдним клітинам, Москва, 1971).

Як виявилося, віруси можуть розмножуватися не тільки в культурах клітин, що утворюють моношар на склі пробірок, але і в суспензіях живих клітин.

Таким чином, для виділення чистих культур вірусів в даний час використовують найчастіше зараження курячих ембріонів, первинно-трипсінізірована і перещеплюваних культур клітин.

Широке поширення набув запропонований в 1952 р Р. Дюльбекко метод бляшок (негативних колоній), що дозволяє проводити кількісне визначення вірусів. Для виділення вірусів моношар клітин після видалення живильного середовища заражають вируссодержащим матеріалом і покривають шаром агару, що містить індикатор нейтральний червоний. Чашки (флакони) інкубують при температурі 37 ° С. Через 48-96 год виявляються плями-бляшки. Вони мають діаметр 1-3 мм і виглядають незабарвленими на рожевому тлі. Плями виникають за рахунок цитопатичної дії вірусу. Цей метод дозволяє безпосередньо виявляти зростання вірусів.

Розрізняють два механізми загибелі клітин, що викликається вірусами, - некроз і апоптоз. Некроз відбувається через необоротних порушень цілісності клітинних мембран, апоптоз - внаслідок фрагментації ядерної ДНК під дією клітинної ендонуклеази. Встановлено, що апоптоз відіграє важливу роль в патогенезі інфекцій, що викликаються поруч РНК-вірусів (ретровірусів, миксовирусов, альфавірусов, буньявірусов, пикорнавирусов, флавивирусов).

Цитопатична дію вірусів може проявлятися у вигляді наступних змін:

1) Рівномірне дрібнозернистий деструкція клітин (поліовірусу, віруси Коксакі та ін.).

2) Очаговий дрібнозернистий дегенерація клітин (вірус грипу, кліщового енцефаліту та ін.).

3) гроздевідное дегенерація клітин (аденовіруси).

4) Грубозерниста рівномірна деструкція клітин (вірус герпесу).

5) Сімпластообразованіе (респіраторно-синцитіальних вірус, вірус кору та інші).

Про зростання вірусів в клітинах можна судити також по поведінці індикатора, який додається до живильному середовищі. Якщо клітини активно здійснюють метаболізм, рН середовища зсувається в кислу сторону, і середовище забарвлюється в жовтий колір. У разі розмноження вірусу клітки гинуть, рН середовища мало змінюється, і вона зберігає первинний (малиновий) колір або (при нейтральній рН) набуває помаранчевий. Деякі віруси, зокрема вірус грипу, мають особливі рецепторами (гемаглютиніни), за допомогою яких вони адсорбуються на еритроцитах і викликають їх склеювання (гемаглютинацію). Такі віруси легко виявляються за допомогою реакції гемаглютинації або гемадсорбції (еритроцити адсорбуються на інфікованих вірусами клітинах культури тканин, див. Кол. Вкл., Рис. 79,1). Крім того, для виявлення вірусу в культурах клітин можуть бути використані різні серологічні реакції: преципитации в агарі, иммунофлуоресценции, РСК, ІФМ тощо., А також метод ДНК-зонда і зараження тварин, чутливих до даного вірусу.

4. Будова бактеріофагів. Взаємодія Т-фагів з мікробної клітиною (адсорбція, проникнення фаговой ДНК в клітину, розмноження фага і вихід його з клітки). Лізогенія і лізогенна конверсія, механізм. Практичне використання фагів в медицині.

Бактеріофагі- віруси бактерій. Бактеріофаги - процес взаємодії фагів з бактеріями, що закінчується дуже часто їх руйнуванням.

Оскільки природним місцем існування будь-якого фага є мікробна клітина, життя фагів пов'язана з бактеріями. Фагів притаманні всі біологічні особливості, які властиві вірусам. Їх геном представлений або ДНК, або РНК і ув'язнений в білкову оболонку (капсид), структурні субодиниці якої покладені на кшталт або спіральної, або кубічної симетрії. Великі фаги, що мають хвостик, влаштовані за типом бінарної симетрії (головка - ікосаедр, хвостик - спіральна симетрія). Фаги відрізняються за формою - ниткоподібні, сферичні; фаги, що мають головку і хвостик; за розмірами - дрібні, середнього розміру і великі. Чим більше фаги, тим більше у них генів і складніше їх життєвий цикл.

Лізогенія і лізогенна конверсія, механізм.

Життєвий цикл фага може проявлятися в формі продуктивної (фаг розмножується в клітині і виходить з неї), редуктивного (геном фага проникає в клітину, проте розмноження фага не відбувається, його геном інтегрується в хромосому клітини-господаря, стає її складовою частиною, т. Е . фаг перетворюється в профаг, а клітина стає лізогенной) і абортивної інфекції, при якій взаємодія фага з клітиною обривається на якійсь стадії життєвого циклу фага, і він гине.

Клітка, що несе профаг, називається лізогенной, тому що профаг, що передається кліткою у спадок, може вийти з хромосоми, активуватися і викликати продуктивну форму інфекції.

Якщо в результаті лизогении, т. Е. Впровадження профага в хромосому клітини-господаря, вона отримує нові успадковані ознаки, таку форму її мінливості називають лізогенной конверсією, т. Е. Мінливістю, обумовленою Лізогенія. Лі-зогенную конверсію викликають лише помірні фаги.

Взаємодія Т-фагів з мікробної клітиною:

1) Адсорбція фагів на клітинної поверхні бактерій за допомогою специфічних рецепторів (білків-лоцманів), які розташовуються на кінчику нитки, шпильки або хвостика. У свою чергу, на клітинній стінці бактерії розташовуються її фагоспеціфіческіе рецептори, які розпізнаються фагом.

2) Проникнення фагового генома через клітинну стінку і цітоплазматіче- ську мембрану всередину клітини і звільнення його від оболонки (роздягання фага).

3) Встановлення фагового генома за допомогою білка-лоцмана для реалізації міститься в геномі інформації:

4) Реплікація фаговой геномної ДНК або РНК.

5) Складання знову синтезованих віріонів - висновок геномної НК в білкову оболонку, морфогенез фагів.

6) Вихід знову синтезованих фагів з клітки:

а) шляхом отпочковиванія;

б) шляхом лізису клітини зсередини. Він здійснюється вільним лизоцимом і викликає загибель клітини.

Практичне застосування фагів. Завдяки своїй руйнівній (литическому) дії на бактерії фаги можуть бути використані з лікувально-профілактичною метою при різних захворюваннях (дизентерія, холера, різні гнійно-запальні захворювання і т. Д.). Набори стандартних фагів, в тому числі міжнародні, використовуються для фаготипирования збудників ряду хвороб (холери, черевного тифу, сальмонел- Льозов, дифтерії, стафілококових та інших захворювань). Фаги широко використовують для вивчення генетики мікроорганізмів.

Дата додавання: 2015-01-29; переглядів: 50; Порушення авторських прав