«Транскріптоміка мікобактерій як спосіб вивчення механізмів контролю латентного туберкульозу»

Прес-центр / новини / наука /

До сих пір у вчених немає повного розуміння того, що саме відбувається в клітинах M. tuberculosis в спочиває стадії. Проте, відповідь на це питання є нагальною потребою, оскільки без нього неможливо знайти способи перемогти туберкульоз. Співробітники лабораторії Структури і функції генів людини Інституту біоорганічної хімії імені академіків М. М. Шемякіна і Ю. А. Овчинникова Т. Л. Ажікіна і Д. В. Ігнатов досліджували транскриптом представників роду Mycobacterium і виявили можливі молекулярні механізми, які беруть участь у встановленні та підтримці стану спокою бактеріальних клітин. Результати цієї роботи були представлені Д. В. Ігнатовим на X Молодіжній школі-конференції з міжнародною участю «Актуальні аспекти сучасної мікробіології».

Євсєєв Антон

З бактерією Mycobacterium tuberculosis людство знайоме вже близько 5000 років, проте до цих пір медицина не може повністю перемогти туберкульоз - захворювання, яке викликає цей мікроорганізм. Справа в тому, туберкульозна інфекція починається з потрапляння M. tuberculosis в легені людини. При цьому швидко формується імунна відповідь, і значна частина бактерій поглинаються легеневими макрофагами. Однак, оскільки мікроорганізми мають здатність виживати всередині макрофагів, частина бактерій залишається цілими і неушкодженими. Таким чином, справа не доходить до повного знищення збудників інфекції, і вона переходить в приховану форму.

Макрофаги, в свою чергу, можуть пригнічувати ріст бактерій, роблячи середу їхнього життя більш кислої, а цього M. tuberculosis вельми не любить. Після цього інфіковані макрофаги мігрують у внутрішні тканини легені, де навколо них виникає гранульома - комплекс з різних імунних клітин. Така гранульома може існувати протягом декількох років - це і відповідає стадії латентної туберкульозної інфекції. Самі ж бактерії всередині гранульоми переходять в дормантное стан, під час якого вони практично не діляться, а рівень їх метаболізму досить низький. Однак, перебуваючи в подібному стані, вони стають мало сприйнятливі до впливу багатьох зовнішніх факторів - в тому числі і ліків.

Транскриптом Mycobacterium tuberculosis в дормантном стані

Відповісти на питання, що саме відбувається в клітинах M. tuberculosis всередині гранульоми, досить складно, оскільки немає модельних тварин, на яких можна точно відтворити гранулему, та й кількість бактеріальних клітин всередині неї досить мало. Проте, відповідь на це питання є нагальною потребою, оскільки без нього вчені так і не зможуть знайти способи перемогти туберкульоз. Втім, зараз розроблені різні in vitro моделі, використовуючи які, можна перевести бактерій в дормантное стан для того, щоб вивчити те, що відбувається в цей час всередині клітин M. tuberculosis.

Саме таке дослідження і було проведено співробітниками лабораторії Структури і функції генів людини ИБХ РАН Т. Л. Ажікіной і Д. В. Ігнатовим, які вивчали транскріптоміку представників роду Mycobacterium спільно з науковими колективами з Федерального дослідного центру «Фундаментальні основи біотехнології» РАН і Центрального науково-дослідного інституту туберкульозу РАМН (Обидва - Москва). У процесі роботи були з'ясовані багато цікавих моменти, пов'язані з транскріптомом мікобактерій.

Що ж таке транскриптом? Це набір всіх РНК, присутніх в бактеріальної клітці. Цікаво, що понад 80 відсотків транскріптома складають рибосомальні РНК. Частка ж мРНК, хоча вона і може варіювати в залежності від фази зростання, як правило, невелика - менше 5 відсотків. Все інше - це транспортні (10 відсотків) і різні регуляторні РНК. Основними типами регуляторних РНК у бактерій є рібопереключателі і малі РНК. Рібопереключателі розташовуються в нетрансльовані областях мРНК генів. Вони працюють таким чином - при зв'язуванні з ними будь-яких низькомолекулярних речовин починається активація або пригнічення трансляції цих самих генів. На відміну від рібопереключателей, малі РНК транскрибуються незалежно від регульованих ними генів. Комплементарна взаємодія малих РНК з мРНК призводять або до активації, або до пригнічення трансляції цих генів.

Регуляторні РНК у бактерій

Таким чином, вивчаючи транскриптом, можна дізнатися, які саме гени активні в клітці в даний момент, а які, навпаки, не працюють. Також подібні дослідження дають уявлення про те, як регулюються багато процесів, що відбуваються в клітинах мікроорганізмів. Це ж, у свою чергу, дозволить зрозуміти, як саме клітина мікобактерії переходить в дормантное стан і що відбувається з нею в цій стадії життєвого циклу.

При вивченні транскріптома мікобактерій дослідники використовували RNA-seq, або метод секвенування РНК. В його основі лежить секвенування фрагментів кДНК за допомогою секвенаторов нового покоління. За допомогою методу RNA-seq можна здійснювати пошук нових генів у бактерій, включаючи гени регуляторних і кодують РНК, з граничною точністю (до одного нуклеотиду) картировать кордон транскриптов, вимірювати рівні транскрипції генів в широкому діапазоні і визначати структури оперонов.

Суть цієї методики полягає в наступному - спочатку з бактеріальної клітини виділялася вся РНК. Потім потрібно було позбутися від найчисленнішою, але абсолютно не цікавою для нашого дослідження рибосомальної РНК. Потім залишок фрагментованим і до кожного фрагменту прикріплялися 5 'і 3' кінцеві адаптери, які потрібні для затравки синтезу кДНК. Після цього відбувався синтез і ампліфікація кДНК, а потім - секвенування цих ДНК за допомогою секвенаторов нового покоління. На основі отриманих в результаті секвенування даних будувалися карти генів бактерій, які аналізувалися за допомогою методів біоінформатики.

Підготовка зразка до RNA-seq

Об'єктами дослідження були клітини на Mycobacterium avium і Mycobacterium tuberculosis - останні при цьому перебували в дормантном стані. За словами Д. В. Ігнатова, «коли ми починали нашу роботу, то існувало тільки одне подібне дослідження, що проводилося на клітинах M. tuberculosis в культурі. Зараз же є близько десятка робіт, присвячених вивченню транскріптомов цих бактерій ». Це говорить про те, що до сих пір процеси, що відбуваються в клітинах мікобактерій в спочиває стадії, вивчені досить погано.

Зараження патогенних мікроорганізмів Mycobacterium avium призводить до виникнення цілого ряду хвороб у тварин і людини. Так, підвиди M. avium avium і M. avium silvaticum викликають захворювання птахів, а підвид M. avium paratuberculosis - хвороба Джонса жуйних тварин. Для людини найбільшу небезпеку становить підвид M. avium hominissuis, який широко розповсюджений у навколишньому середовищі, який при потраплянні в організм людини здатний викликати дисеміновані захворювання легень у людей з імунодефіцитом. Слід зауважити, що патогенез Mycobacterium avium схожий з таким M. tuberculosis - цей мікроорганізм також здатний концентруватися всередині макрофагів. Тому вивчення транскріптомов даного мікроорганізму може допомогти зрозуміти, які процеси відбуваються в дормантних клітинах M. tuberculosis, які складно вивчати in vivo.

після секвенування транскріптома Mycobacterium avium було отримано кілька десятків мільйонів причетний, причому частина з них виявилася локусами рибосомних РНК - і це незважаючи на те, що її намагалися видалити. Частина локусів картірован в області мРНК, частина - в міжгенних областях (причому таких було навіть більше, ніж трансльованих локусах), і частина з них виявилася антисмислового послідовностями частин мРНК. Очевидно, що два останніх типу прочитання мають відношення до регуляторних малим РНК.

В результаті дослідникам вдалося ідентифікувати кілька малих РНК з транскріптома M. avium і порівняти їх з такими M. tuberculosis. З'ясувалася, що велика частина цих малих РНК має гомологи у M. tuberculosis за винятком декількох з них. Так, в геномі M. avium відсутні гомологи двох малих РНК M. tuberculosis, такі як MTS0479 (імовірно працює тоді, коли клітина відчуває кислотний стрес) і MTS1338 (синтезується під час стаціонарної фази і при гіпоксії). У свою чергу у M. tuberculosis відсутні гомологи чотирьох малих РНК M. avium, функції яких не відомі.

Транскриптом Mycobacterium avium при зростанні в культурі

Ще одне джерело причетний були локуси з 5'-нетрансльовані областей. Дослідники розробили алгоритм картування транскрипційних старт-сайтів (ТСС) на транскрипционном профілі. І тут з'ясувалася цікава річ - 33% ТСС збігалися зі старт-кодонами, тобто вони відповідали безлідерним мРНК. Це досить незвично для бактерій, у яких такі мРНК зустрічаються вкрай рідко - вони відомі лише для кількох десятків генів. Абсолютно незрозуміло, чому їх було так багато у мікобактерій - на думку авторів роботи, це питання вимагає подальшого детального вивчення. Кілька ж досить довгих 5'-нетрансльовані областей відповідали рібопереключателям різних генів.

Аналіз 5'-нетрансльовані областей

Дослідження транскріптомов Mycobacterium tuberculosis в дормантном стані проводилися на моделі, яка була розроблена в лабораторії проф. А.С. Капрельянц з Інституту біохімії ім. А.Н. Баха РАН . Клітини M. tuberculosis культивувалися в рідкому середовищі, де були відсутні іони калію. Вирощені таким чином бактерії набували вельми цікаві властивості: вони втрачали здатність рости на твердому середовищі, і були нечутливі до впливу декількох різновидів антибіотиків. Крім того, ці мікроорганізми мали незвичайну морфологію клітин, у них був знижений синтез АТФ і дихання, а також було знижено вміст ліпідів. Що стосується рівня транскрипції, то він теж був досить низьким. Через два дні такий культивації в колонію M. tuberculosis додавали антибіотик рифампіцин в інгібуючої концентрації (5 μg / ml), який вбивав все активно діляться клітини. Таким чином, в культурі залишалися тільки дормантние мікроорганізми.

Модель дормантного стану M. tuberculosis

Т. Л. Ажікіна і Д.В. Ігнатов вивчили транскріптоміку клітин M. tuberculosis на ранній дормантной стадії, тобто перед додаванням рифампіцину, а також тих, що перебували на стадії пізнього дормантного стану, яке настало через кілька днів після ін'єкції антібіоткі. Цікавою властивістю транскріптома дормантних клітин було розрізання 23S рибосомальної РНК. Дослідникам вдалося картировать точку розрізання 23S рРНК - з'ясувалося, що вона розташовується досить далеко від каталітичного центру рибосоми, і, пÐ