Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Ми раніше повідомляли синтезу з моно - і ді гідрокси L-lysines diastereoselective ферментативні гидроксилирования, каталізують dioxygenases заліза (II) / αKAO сім'ї (рис. 1) 16. Для оптимізації протоколу всій каскади, представлені тут, які поєднують в собі один або два кроки гидроксилирования, каталізують αKAO пішов крок декарбоксилирования, каталізують ПЛП-DC, умов реакції були скориговані для задоволення вимог обох ферментативних реакцій. Ми почали з розслідуванням діяльності двох DCs, НРСSrum і постійного токаCpin, до комерційно доступних (5 R) - гідрокси - L-лізин. Потім ми assayed DC діяльність на моно похідних, 3-гідрокси L-лізин (1) і 4-гідрокси L-лізин (2), в каскаді з кроком окислення, каталізують відповідні αKAO. У таблиці 1 представлені результати биокаталитических decarboxylations моно гідрокси L-lysines. Перетворення були виміряні за HPLC після деривації реакційної суміші з DNFB дати відповідні DNB деріватние субстратів і продуктів. ВхідСубстратPLP-DCПродуктуПеретворення

1 (5 R) - гідрокси - L-лізин НРСSrumb) 4 100% 2 (5 R) - гідрокси - L-лізин DCCpinb) 4 н.д. 3 1) НРСSrumb) 5 100% 4 1) DCCpinb) 5 29% 5 2) НРСSrumc) 6 60% 6 2) DCCpinc) 6 100%

Таблиця 1: биокаталитических декарбоксилирования monohydroxy-L-lysines. Умови реакції: субстрат (10 мм), ПЛП-DC (01-015 мг мл-1), HEPES буфера (50 мм, pH 7.5), ПЛП (1 мм), DTT (1 мм, не використовується з НРСSrum), ночівля, RT, 300 об / хв. () Синтезується ферментативно в situ. (B) 0,1 мг / мл. (C) 0,15 мг / мл; н.д .: не виявлено

DC від S. rumirantium (SrumНРС) виставлені діяльності на всіх моно гідрокси lysines з найкраще перетворення 3 - і 5-похідних для відповідного хіральна гідрокси діаміни (записи 1, 3 і 5). Як і очікувалося, DCCpin, DC αKAO геномної контексту, виявився найбільш підходящим для декарбоксилирования (4 R) - гідрокси - L-лізин (2) (елемент 6). При стандартній реакції умовах перетворення (3 S) - гідрокси - L-лізин (1) в її колегою декарбоксилировать (5) з DCCpin був низьким (елемент 4) і ніякої діяльності було відзначено до (5 R) - гідрокси L-лізин (пункт 2).

Нарешті, ми розглянули діяльність двох DCs до ді гідрокси L-лізин похідні 3, 8 і 9, синтезується в situ один або два кроки гидроксилирования, каталізують KDO1, KDO2 або поєднання цих двох (Малюнок 2). в таблиці 2 резюмуються результати биокаталитических декарбоксилирования ді гідрокси L-lysines.

1 3 НРСSrumb) 7 н.д. 2 3 DCCpinb) 7 100% 3 8) НРСSrumb) 10 19% 4 8) DCCpinb) 10 12% 5 9) НРСSrumc) 11 н.д. 6 9) DCCpinc) 11 н.д.

Таблиця 2: биокаталитических декарбоксилирования дигідрокси L-lysines. Умови реакції: субстрат (10 мм), ПЛП-DC (01-015 мг / мл), HEPES буфера (50 мм, pH 7.5), ПЛП (1 мм), DTT (1 мм, не використовується з НРСSrum ), ночівля, RT, 300 об / хв. () Синтезується ферментативно в situ. (B) 0,1 мг / мл. (C) 0,15 мг / мл; н.д .: не виявлено.

Що стосується декарбоксилирования дигідрокси L-lysines 3, 8 і 9 результати не були повністю задовільними. В умовах стандартного реакції, тільки (3 R, 4 R) - дигідрокси - L-лізин (3) кількісно був перетворений у відповідний дигідрокси диамин 7 (записи 1 - 2). Перетворення 4,5-дигідрокси L-лізин (8) був вмеру (записи 3-4), але це варто відзначити, що він може бути поліпшена, значно збільшуючи ферменту завантаження. Жоден з двох протестованих ПЛП-DCs були виявлені активні до 3,5-дигідрокси L-лізин (9) (записи 5-6).

Каскад ферментативних реакцій, експонується кількісні перетворення як визначається ВЕРХ моніторингу були успішно розширені (рис. 4).

Малюнок 4: представник аналітичні дані для каскад ферментативних триступеневої. (A) ВЕРХ моніторинг биокаталитических перетворення L-лізин в (2 R, 3 R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-діол (7). RT = час утримання. (B) 1H ЯМР і (C) в 13C ЯМР аміно алкоголю (7) після очищення. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Протокол очищення, представлені тут дозволяє ефективного вилучення аміно спиртів з суміші складних ферментативної реакції. Аміно спирти 4, 5, 6 і 7 були отримані хороші врожаї (рис. 5).

Малюнок 5: ензимний каскадів для синтезу амінокислот спиртів. Синтез (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (4), (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (5), 1,5-diaminopentan-3-ол (6), і ( 2 R, 3 R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-діол (7). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.