ПОРІВНЯННЯ Цитотоксичність ДВОХ антрациклінової АНТИБІОТИКІВ ЩОДО НОРМАЛЬНИХ І ПУХЛИННИХ ЛІНІЙ клітин

1. бібліографічна посилання

1 Анікіна Л.В. 1 Семаков А.В. 1 Пухов С.А. 1 Афанасьєва С.В. 1 Клочков С.Г. 1

1 Федеральне державне бюджетна установа науки Інститут фізіологічно активних речовин Російської академії наук

Було проведено порівняння цитотоксичности антрациклінових антибіотиків даунорубіцином і доксорубіцину щодо пухлинних і нормальних ліній клітин. Обидва препарати проявили сильно виражений протипухлинний ефект. Відносно карциноми легені А549 і карциноми кишечника НСТ116 даунорубіцин і доксорубіцин діють аналогічно. Лінії клітин рабдоміосаркоми RD, аденокарциноми молочної залози MCF7 і нормального ембріонального епітелію нирки собаки MDCK-M в 2-5 разів менш чутливі до дії даунорубіцином. Існує різниця в чутливості до досліджуваних антрациклінів нормальних клітин. Токсичність антрациклинов щодо лінії MDCK-M вище, ніж токсичність до пухлинних лініях клітин. Лінія клітин нормального ембріонального епітелію нирки людини НЕК293 мало чутлива до дії антрациклінів антибіотиків. Токсичність доксорубіцину щодо лінії НЕК293 в 13,5 разів менше токсичності даунорубіцином. Таким чином, токсикологічний профіль доксорубіцину і даунорубіцином in vitro повторює клінічний профіль даних препаратів. Різниця в токсичності антрациклинов по відношенню до нормальних і пухлинних клітин очевидна, проте вимагає додаткових експериментів з клітинами різних типів тканин і видів ссавців.

антрациклінові антибіотики

даунорубіцин

доксорубіцин

МТТ-тест

цитотоксичность

1. Arcamone F. Doxorubicin, Anticancer Antibiotics // In: Medicinal Chemistry, a Series of Monographs, vol. 17. - Academic Press, New York, 1981.

2. Beretta GL, Zunino F. Molecular mechanisms of anthracycline activity // Top. Curr. Chem. - 2008. - 283. - P.1-19.

3. Chaires JB, Leng F. et al. Structure-based design of a new bisintercalating anthracycline antibiotic // J. Med. Chem. - 1997. - 40. - P.261-266.

4. Chu LL, Pandey RP et al. Synthetic analog of anticancer drug daunorubicin from daunorubicinone using one-pot enzymatic UDP-recycling glycosylation // J. Mol. Catalysis B: Enzymatyc. - 2016. - 124. - Р. 1-10.

5. Czyz M., Szulawska A. et al. Effects of anthracycline derivatives on human leukemia K562 cell growth and differentiation // Biochem. Pharmacol. - 2005. - 70. - Р. 1431-1442.

6. Karsten Krohn. Anthracycline Chemistry and Biology II: Mode of Action, Clinical Aspects and New Drugs // Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 2008.

7. Menna P., Salvatorelli E. et. al. Anthracicline cardiotoxicity // Top. Curr. Chem. - 2008. - 283. - P.21-44.

8. Monneret C. Recent developments in the field of antitumour anthracyclines // Eur. J. Med. Chem. - 2001. - 36. - Р. 483-493.

9. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay // J. Immunol. Meth. - 1983. - 65 (1-2). - P. 55-63.

10. Rodrigues PCA, Roth T. et al. Correlation of the acid-sensitivity of polyethylene glycol daunorubicin conjugates with their in vitro antiproliferative activity // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2006. - 14. - Р. 4110-4117.

11. Tewey KM, Rowe TC, Yang L., Halligan BD, Liu LF Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II // Science. - 1984. - 226. - Р. 466-468.

Антрациклінові антибіотики даунорубіцин і доксорубіцин були введені в клінічну практику більше 40 років тому для лікування широкого спектру онкологічних захворювань, таких як гостра мієлоїдна лейкемія і, у випадку з доксорубіцином, багато сóлідние пухлини. Самі по собі і в комбінації з іншими препаратами антрацикліни є компонентами основного, допоміжного і паліативного лікування [1].

Незважаючи на інтенсивне клінічне застосування антрациклінів, їх механізми дії є об'єктом для дискусій внаслідок використання різних концентрацій і умов експерименту. Однак деякі дані не підлягають сумніву. По-перше, в терапевтичних дозах і при внутрішньовенному способі введення механізм дії антрациклінів антибіотиків обумовлений взаємодією з топоізомеразою II шляхом стабілізації потрійного комплексу ДНК-топоізомераза II-антрациклін [11]. По-друге, обмежуючим фактором прийому антрациклінів антибіотиків є кумулятивна кардиотоксичность і розвиток резистентності пухлин [8].

Кардіотоксичність, яку викликають антрациклінові антибіотики, обмежує їх клінічне застосування. Пацієнти, які приймають антрацикліни, страждають від аритмії, гіпотензії, пригнічення скоротливості серця, можливе виникнення міокардиту. В кардіоміоцитах антрацикліни є причиною судинної дегенерації, мітохондріальних включень, миофибриллярних мерехтінь і тріпотіння, збільшення кількості лізосом і некрозу. Максимальна рекомендована доза для даунорубіцином становить 500 мг, а для доксорубіцину - 450-600 мг на весь курс лікування. Це доза являє собою суму доз, які прийняв пацієнт, навіть якщо між циклами прийому були проміжки в місяці і роки. При перевищенні рекомендованих доз розвивається дилятаційнукардіоміопатія і серцева недостатність [7]. Крім кардиотоксичности частим ускладненням після терапії антрациклінової антибіотиками є токсична дія на інші паренхіматозні органи, наприклад нефротоксичність [2].

Розвиток резистентності пухлинних клітин знижує ефективність протипухлинної терапії і вимагає збільшення доз препарату, що в разі антрациклінових антибіотиків неприпустимо. Розвиток резистентності пухлин пов'язують сo взаємодією між антрациклінами і транспортними білками Р-глікопротеїном і білком множинної медикаментозної резистентності MRP через N3 'атом даунозаміна. Надекспресія транспортних систем в пухлинних тканинах грає ключову роль у видаленні антрациклинов з клітин і зменшення взаємодії ліки-мішень [3].

Клінічна затребуваність даунорубіцином і доксорубіцину стимулювала інтенсивний синтез аналогів і структурно близьких сполук [4, 5, 10]. Незважаючи на доклінічні дослідження величезної кількості з'єднань даного класу, тільки мала частина антрациклинов і інших інтеркалірующіх агентів доступна для клінічного використання. Даунорубіцин залишається одним з найбільш ефективних агентів для лікування гострих лімфоїдних і мієлоїдних лейкемій, але його активність відносно сóлідних пухлин мала. Доксорубіцин є найбільш активним препаратом для лікування сóлідних пухлин, особливо при раку молочної залози, дрібноклітинному раку легені і раку яєчників [6].

У зв'язку з тим, що скринінгові дослідження на протипухлинні властивості нових сполук в даний час проводяться в основному в тестах in vitro, порівняння цитотоксичности еталонних препаратів порівняння на різних пухлинних лініях клітин є цікавим. Крім того, подальше порівняння з даними по цитотоксичности, отриманими на культурах нормальних клітин, представляється перспективним для прогнозування токсикологічного профілю речовин в дослідах in vivo. Метою даної роботи є порівняння цитотоксичности антрациклінових антибіотиків даунорубіцином і доксорубіцину щодо пухлинних і нормальних ліній клітин.

матеріали та методи

У роботі використано обладнання Центру колективного користування науковим обладнанням для створення генно-модифікованих ліній тварин і вивчення ефективності з'єднань на оригінальних клітинних і трансгенних моделях нейродегенеративних захворювань людини (угода 14.621.21.0008, ідентифікатор RFMEFI62114X0008).

досліджувані сполуки

Досліджувані сполуки даунорубіцин (DNR) та доксорубіцин (DOX) були синтезовані на ВАТ «Омутнінський наукова дослідно-виробнича база» (п. Східний, Кіровська область). Формули представлені на малюнку.

Скелет антрацикліну складається з тетрациклічні системи з парним хинон-гидрохиноновую кільцями, аміноцукри даунозаміна, пов'язаного гликозидной зв'язком з С7 і короткою бічного ланцюга з карбонільної групою при С13. Відносно малі зміни в цьому кістяку призводять до великих змін в спектрі протипухлинної активності. Антрацикліни з первинним спиртом на кінці бічного ланцюга (DOX і епірубіцин) показують активність як до сóлідним, так і гематологічним пухлин. Антрацикліни з метильной групою (DNR і ідарубіцин) в основному використовуються для лікування гострої мієлобластній лейкемії і пов'язаної зі СНІДом саркомою Капоші.

даунорубіцин Доксорубіцин

культури клітин

В експерименті були використані культури пухлинних клітин людини А549 (карцинома легені, ATCC® CCL-185 ™), HCT116 (карцинома кишечника, ATCC® CCL-247 ™), MCF7 (аденокарцинома молочної залози, ATCC® HTB-22 ™), RD ( рабдоміосаркома, ATCC® CCL-136 ™), а також культури нормальних клітин ембріонального ниркового епітелію людини HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™) і собаки MDCK-M (ATCC® CCL-34 ™).

Культури клітин А549, HCT116, RD і НЕК293 вирощувалися в середовищі DMEM, культура клітин MCF7 вирощувалася в середовищі EMEM, культура клітин MDCK-M - в середовищі DMEM / F12 (всі середовища зроблені в ТОВ НВП «ПанЕко»). У культуральні середовища були додані 10% ембріональної телячої сироватки (HyClone®, Thermo Scientific), 2мM L-глутаміну (ТОВ НВП «ПанЕко») і 1% гентаміцину (ВАТ Біохімік) в якості антибіотика. Культивування відбувалося при 37oC і 5% CO2 у вологому атмосфері.

Визначення цитотоксичности МТТ-тестом

Цитотоксичність даунорубіцином і доксорубіцину була визначена за допомогою МТТ-тесту [9]. Клітини були посіяні в концентрації 1 · 104 клітин / 200 мкл в 96-ямковий планшет і культивувалися при 37 oC у вологому атмосфері з 5% CO2. Після 24 годин інкубації до культурам клітин були додані різні концентрації тестованих сполук (від 100 до 1,56 мкМ / л), і далі клітини культивувалися в тих же умовах 72 години. Кожна концентрація речовин була виконана в трьох повторностях. Всі речовини були розчинені в ДМСО (Panreac Química SLU), кінцева концентрація ДМСО в лунці не перевищувала 0,1% і не була токсична для клітин. Контрольними лунками виступали лунки, в які додавали розчинник в кінцевій концентрації 0,1%. Після інкубації в кожну лунку було додано 20 мкл MTT (3- [4,5-діметілтіазол-2-іл] -2,5-дідіфеніл тетразолия бромід, 5 мг / мл, Sigma-Aldrich), і планшети инкубировались ще 2 години. Далі з планшетів була видалена середовище та в кожну лунку додано 100 мкл ДМСО для розчинення утворилися кристалів формазану. За допомогою планшетного аналізатора (Victor3, PerkinElmer) визначали оптичну щільність при 530 нм за вирахуванням виміряного фонового поглинання при 620 нм. Значення концентрації, що викликає 50% інгібування росту популяції клітин (IC50), було визначено на основі дозозалежних кривих за допомогою програмного забезпечення OriginPro 9.0.

Результати та обговорення

Результати дослідження цитотоксичного ефекту антрациклінових антибіотиків наведені в таблиці. Обидва препарати виявляють сильно виражений протипухлинний ефект. Очевидно, що в відношенні ряду культур - карциноми легені А549 і кишечника НСТ116 - даунорубіцин і доксорубіцин діють аналогічно. Лінії клітин рабдоміосаркоми RD, аденокарциноми молочної залози MCF7 і нормального ембріонального епітелію нирки собаки MDCK-M менш чутливі до дії даунорубіцином. Дози, при яких проявляється ефект даунорубіцином, на цих лініях клітин в 2-5 разів вище, ніж дози доксорубіцину.

Цитотоксичність даунорубіцином і доксорубіцину в МТТ-тесті

З'єднання-ня

IC50, мкМ

A549

HCT116

RD

MCF7

HEK293

MDCK-M

DNR

0,51 ± 0,01

0,21 ± 0,00

2,45 ± 0,07

1,44 ± 0,31

11,17 ± 0,19

0,32 ± 0,00

DOX

0,53 ± 0,02

0,19 ± 0,01

0,53 ± 0,03

0,56 ± 0,03

151,68 ± 13,82

0,19 ± 0,00

Незважаючи на те, що застосування доксорубіцину не показано для лікування раку прямої кишки і тонкого кишечника, цитотоксичность його по відношенню до клітинної лінії НСТ116 в нашому експерименті вийшла вище, ніж по відношенню до клітинних лініях, ближчим за клінічними показаннями для даного препарату (А549 і MCF7). Даунорубіцин, який в клінічній практиці не застосовується для лікування раку легенів і кишечника, в нашому експерименті виявив високу цитотоксичність по відношенню до клітин А549 і НСТ116.

Цікава різниця в чутливості до досліджуваних антрациклінів нормальних клітин, що належать до однієї тканини, але різного виду ссавців. Як представники нормальних клітин були обрані клітини нормального ембріонального епітелію нирки собаки і людини, так як одним з побічних ефектів антрациклінів є нефротоксичність.

Лінія клітин нормального ембріонального епітелію нирки собаки MDCK-M виявила підвищену чутливість до дії і даунорубіцином, і доксорубіцину, причому токсичність цих антрациклинов щодо даної лінії вище, ніж токсичність до пухлинних лініях клітин. На противагу цьому, лінія клітин нормального ембріонального епітелію нирки людини НЕК293 менш чутлива до дії антрациклінів антибіотиків. Причому, якщо IC50 даунорубіцином щодо цієї лінії тільки в 5-50 разів вище, ніж по відношенню до пухлинних культур клітин, то IC50 доксорубіцину в 270-800 разів вище, ніж по відношенню до пухлинних культур. Токсичність доксорубіцину щодо лінії НЕК293 в 13,5 разів менше токсичності даунорубіцином.

Різниця в чутливості клітин нормального ниркового епітелію двох різних видів не може бути пояснена з точки зору різної швидкості проліферації двох культур, так як обидві культури є швидко проліферуючими.

Таким чином, дослідження показало, що токсикологічний профіль антрациклінових антибіотиків доксорубіцину і даунорубіцином in vitro в цілому повторює клінічний профіль даних препаратів. Подальший інтерес представляє дослідження цитотоксичності інших представників антрациклінових антибіотиків - ідарубіцина і епірубіціна, а також порівняльне дослідження цитотоксичності пар клітинних ліній одного генезу, але двох різних типів - пухлинного і нормального. Різниця в токсичності антрациклинов по відношенню до нормальних і пухлинних клітин очевидна, проте вимагає додаткових експериментів з клітинами різних типів тканин і видів ссавців.

Робота виконана за підтримки Гранту РФФД №15-04-0394015.

бібліографічна посилання

Анікіна Л.В., Семаков А.В., Пухов С.А., Афанасьєва С.В., Клочков С.Г. ПОРІВНЯННЯ Цитотоксичність ДВОХ антрациклінової АНТИБІОТИКІВ ЩОДО НОРМАЛЬНИХ І ПУХЛИННИХ ЛІНІЙ клітин // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 2 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24159 (дата звернення: 08.06.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)