РОЗРОБКА ДІАГНОСТИЧНОЇ ТЕСТ-СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ СПЕЦИФІЧНИХ антитіл до Збудником бруцельозу У непрямих методів ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

1. бібліографічна посилання

1 Курчева С.А. 1 Тюменцева І.С. 1 Афанасьєв Е.Н. 1 Жданова Є.В. 1 Старцева О.Л. 1 Жарникова І.В. 1 Гаркуша Ю.Ю. 1 Семірчева А.А. 1

1 ФКУЗ Ставропольський протичумний інститут Росспоживнагляду

Аналіз порівняльних даних про особливості перебігу бруцельозу дозволяє стверджувати, що бруцельоз у людей в останнє десятиліття придбав менш манифестное протягом, що ускладнює його діагностику. У таких випадках надзвичайно актуальними залишаються лабораторні методи дослідження цієї інфекції. Це наголошує на необхідності вдосконалення і розробки нових, більш чутливих і специфічних діагностичних засобів, особливо передбачають експрес-тестування і інструментальний облік результатів тестів. Розроблено діагностична тест-система для виявлення специфічних антитіл до збудника бруцельозу в непрямому методі імуноферментного аналізу при дослідженні біологічного матеріалу від людей та оптимізовано умови її постановки. Наведено результати, які свідчать про досить високу специфічність і чутливість тест-системи, що дозволяє запропонувати її для рутинної діагностики бруцельозу в якості додаткового або альтернативного тесту.

діагностика

бруцельоз

антитіла

ІФА

тест-система

сироватка

кон'югат

1. Афанасьєв Є. М. Порівняльна характеристика антигенної структури бактерій роду Brucella: дис. ... канд. мед. наук. - Ставрополь, 1983. - 173 с.

2. Конструювання тест-системи діагностичної для виявлення антитіл до збудника бруцельозу в непрямому методі імуноферментного аналізу / С. А. Курчева, О. Л. Старцева, А. А. Семірчева, Е. В. Криницина // Актуальні проблеми епідеміології та профілактичної медицини : матеріали VI Всеросійської науково-практичної конференції молодих вчених і фахівців науково-дослідних організацій Росспоживнагляду (22-24 жовтня 2014 г.), 2014. - С. 127-128.

3. Криницина Е. В., Крюкова О. С. Набори регентів ЗАТ «Вектор-Бест» для серологічної діагностики бруцельозу // Новини «Вектор-Бест». - № 4 (70). - 2013: http://www.vector-best.ru/nvb/n70/st70_1.htm; дата звернення: 06.11.14.

4. Оцінка імунного статусу і диференційована імунокорекція при бруцельозі / Г. М. Курманова, А. К. Дуйсенова, К. Б. Курманова, Н. Х. Спірічева // Методичні рекомендації. - Алмати, 2002. - 30 с.

5. Розробка і оптимізація умов постановки тест-системи для діагностики сказу сендвіч методом твердофазного імуноферментного аналізу / Є. С. Жилін, Ж. К. Кошеметов, В. М. Матвєєва, А. Т. Татибаева [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://flatik.ru/es-jilin-jk-koshemetov-vm-matveeva-at-tatibaeva (дата звернення: 02.03.2016).

6. Тюменцева І. С., Афанасьєв Є. М., Єфременко В. І., базік І. А., Алієва Е. В. Спосіб отримання діагностичної сироватки // Патент на винахід № 2135210. - 1999.

7. Яснева Е. А., Константинов А. В. Оптимізація умов постановки непрямого варіанту імуноферментного аналізу для визначення антитіл на штами «ВК» і «К» вірусу хвороби Ауєскі в сироватках крові свиней // Ветеринарна патологія. - 2007. - № 4. - С. 51-55.

Бруцельоз - бактеріальна інфекційно-алергічна хвороба, що відноситься до групи зоонозів і займає особливе становище серед інших інфекційних хвороб через своєрідності збудника. Етіопатогенетичні особливості бруцельозу визначають велику схильність захворювання до хронічного перебігу з тривалою персистенцією патогена. Фактор часу не грає абсолютної ролі у визначенні форми або стадії хвороби, так гострий процес може розвиватися на тлі латентного бруцельозу, а хронічний перебіг може розвиватися з самого початку хвороби. Як правило, після консультації інфекціоніста для виключення можливого бруцельозу кров пацієнта тестують тільки в реакціях Хеддельсона і Райта, що володіють, за інформацією ряду авторів, невисокою чутливістю (35-64%). Із сучасних серологічних методів діагностики бруцельозу імуноферментний аналіз (ІФА) є найбільш доступним і поширеним [2, 3, 4]. Явні переваги цього тесту - простота і швидкість виконання, висока чутливість, стабільність реагентів, можливість кількісного обліку реакції, обробка великої кількості проб, автоматизація процесу і об'єктивність інструментального обліку результатів [5]. Метод імуноферментного аналізу знаходиться в постійному розвитку. З одного боку, розширюється число об'єктів дослідження, з іншого - заглиблюються і удосконалюються методи самого аналізу [7]. Специфічність і чутливість ІФА залежить від якості використовуваних іммунореагентов і оптимізації постановки тесту.

Метою цієї роботи стало вивчення можливості виявлення антитіл в сироватках крові людей при хронічному перебігу бруцельозу в иммуноферментном аналізі.

Провівши аналіз отриманих результатів, нами була сконструйована експериментальна тест-система діагностична для виявлення специфічних антитіл в сироватках крові хворих на гострий та хронічний бруцельоз в непрямому методі постановки імуноферментного аналізу (НІФА).

матеріали та методи

Як сенсибилизирующего агента був апробований полівалентний бруцеллезний водорозчинний антиген (Аг-в / р), витягнутий по методу Е. Н. Афанасьєва з суміші бакмасс Brucella (B.) abortus19ABB. melitensisRev-1, B. suis61, стерильних охолодженим до мінус 20 ° С ацетоном [1].

Для отримання кролячій сироватки проти Ig G людини проводили гипериммунизации за схемою, розробленою І. С. Тюменцева з співавторами [6]. Схема заснована на підборі оптимальної комбінації інтактних і полімеризованих Ig G, виділених з нормальною сироватки крові людини, а також імуномодуляторів тималіну та циклофосфану. Як донори антивидових IgG були взяті кролики породи «Шиншила», масою 3-3,5 кг. Гипериммунизации проводили з дотриманням відоідентічності антигенів і виду продуцентів, використовуючи IgG, виділені з нормальною сироватки крові людини, і імуномодулятори тималин і циклофосфан.

Кон'югацію кролячих Ат проти Ig G людини з індикаторним ферментом - пероксидазою хрону (ПХ) (тип VI-А, Rz: ~ 3.0 з активністю 1550 units / mg (Sigma)) проводили за методом Перйодатна окислення по PK Nakane, A. Kawaoi (1974 ) в модифікації MB Wilson, PK Nakane (1978).

Результати ІФА реєстрували за допомогою фотометра «Multiskan FC», вимірюючи оптичну густину (ОГ), використовуючи фільтр з довжиною хвилі 450 нм. За результатами ОП розраховували значення критичної оптичної щільності (ОПКР.) За формулою 1:

ОПКР. = ОГсер К + 0,2 (1),

де ОПсрК- - середнє значення ОГ для негативного контрольного зразка.

Для інтерпретації результатів дослідження застосовували коефіцієнт позитивності (КП):

КП = ОПіссл. сив. / ОПКР. (2).

При КП <1,0 результат оцінюється як негативний.

КП ≥ 1,0 - результат позитивний.

Для визначення діагностичної цінності сконструйованої тест-системи використали сироватки крові хворих і здорових людей.

В якості твердої фази - полістиролові планшети фірми «Costar» (USA).

Результати та обговорення

Основні параметри ІФА, а саме чутливість, точність і відтворюваність, можуть істотно змінюватися при варіюванні умов проведення експерименту (температура, іонна сила і рН реакційного середовища, концентраційні співвідношення компонентів і тривалість їх взаємодії). Це визначає необхідність оптимізації кожної стадії аналізу, для чого використовували емпіричний підбір параметрів постановки тесту.

При створенні діагностичного тесту важливим моментом є визначення його антигенну композиції і умов адсорбції на твердій фазі, т. Е. Встановлення оптимальної концентрації антигену (Аг), складу сенсибилизирующего буфера, умов відмивання не пов'язаної компонентів, часу і температури зв'язування Аг з поверхнею полістиролів планшетів. Оптимальну сенсибилизирующей дозу бактеріального агента визначали в серії дослідів з сироватками крові хворих на бруцельоз і здорових людей проти иммуноглобулинового пероксидазного коньюгата. В експериментах випробовували різні концентрації Аг в інтервалі 10 ÷ 300 мкг / мл. Процес адсорбції Аг оцінювали за інтенсивністю реакції з контрольними сироватками крові людей. Найбільш оптимальний рівень насичення поверхні планшет досягався при концентрації білка, що дорівнює 100 мкг / мл, при цьому сироватки здорових людей реагували негативно.

Для визначення оптимальних умов сенсибілізації планшета Аг-в / р оцінювали інтенсивність реакції при інкубації в термостаті (37 ± 1) ° С протягом (3, 2, 1 ч) і з використанням термошейкер при тій же температурі (250 об. / Хв) , а також 18 ч при температурі 4 ° С (рисунок 1). Встановлено оптимальний режим - при температурі 37 ° С протягом 2 год або в умовах термошейкер протягом 1 год, в той час як при інших значеннях витримки адсорбційна здатність Аг-в / р, а також специфічність реакції трохи нижче. Інкубація при температурі 4 ° С можлива за певних умов розрахунку часу постановки реакції без втрати чутливості і специфічності.

Рис.1. Залежність КП від зміни умов інкубації

Щоб виключити неспецифічну реакцію на імунний комплекс Аг-Ат, були проведені дослідження щодо зменшення «фонових перешкод» з використанням бичачого сироваткового альбуміну (БСА) і казеїну в концентрації 0,05-1,0% в буфері для розведення сироваток крові людей і иммуноглобулинового пероксидазного кон'югату. Встановлено, що блокування вільних центрів зв'язування доцільно проводити 0,1% розчином БСА на ФСБ рН 7,2 ± 0,2 с додаванням неионного детергента Твін 20 до 0,05%.

Далі були вивчені особливості взаємодії досвідчених сироваток крові з іммобілізованим на поверхні полістиролу специфічним Аг-в / р з в інтервалі від 15 до 90 хв при температурі 37 ° С і імунопероксидазному кон'югатом (15; 30 і 40 хв). Як показано на графіку (рисунок 2), оптимальний час інкубації сироваток - 60 хв, аінкубацію імунопероксидазному кон'югату - 30 хв. У більш короткий термін - не відбувається ефективної взаємодії компонентів реакції, а збільшення тривалості інкубації не тільки подовжує час постановки реакції, але і сприяє появі фонового фарбування.

Мал. 2. Залежність показань КП від часу інкубації сироватки і иммуноглобулинового пероксидазного кон'югату

Важливим для проведення ІФА є визначення кінетики зв'язування і концентрації пероксидазного кон'югату. У дослідах максимальні значення були констатовані при робочому розведенні кон'югату 1: 3000 при його взаємодії з випробуваними сироватками - 30 хвилин при температурі 37 ° С.

При випробуванні чутливості тест-системи використали різні розведення (від 1:10 до 1: 100) сироваток крові хворих на гострий та хронічний бруцельоз, які вносили в лунки планшет сенсибілізованих Аг-в / р. Постановка реакції здійснювалася згідно відпрацьованим параметрам. Чутливість виявлення специфічних антитіл оцінювали за середньою величиною КП. Середнє значення КП при розведенні сироватки 1:10 становить 2,140 ± 0,129 при розведенні сироватки 1: 100 - 2,658 ± 0,221. Число ступенів свободи (f) = 13. Парний t-критерій Стьюдента = 3689. Критичне значення t-критерію Стьюдента при даному числі ступенів свободи становить 2,16. tнабл. > Tкріт., Зміни ознаки статистично значущі (р <0,05).

Мал. 3. Залежність показань коефіцієнта позитивності від розведення сироватки

Проведені дослідження дозволили сконструювати діагностичний набір реагентів тест-систему діагностичну для виявлення антитіл до збудника бруцельозу в НІФА (експериментальні серії). До складу набору входять наступні компоненти: позитивний контроль (інактивований) - 1 ампула (0,1 мл); кон'югатпероксідазнийіммуноглобуліновий сухий - 1 ампула (0,1 мл); антиген бруцельозного мікроба (полігрупповой) в концентрації 10,0 мг / мл сухого 1 ампула (0,25 мл); фосфатно-сольовий буфер (ФСБ), суха навішування - 1 флакон; бичачий сироватковий альбумін (БСА), суха навішування - 1 флакон; твін 20 - 1 флакон; тетраметилбензидин (ТМБ) - 2 флакона; 4 N розчин сірчаної кислоти (стоп-реагент) - 1 флакон; планшет полістироловий для ІФА одноразового застосування з об'ємом лунки 0,4 мл - 1 шт .; скарифікатор дисковий ампульний керамічна - 1 шт.

Здатність тест-системи виявляти антитіла до збудника бруцельозу при різних формах захворювання була показана в НІФА з 24 сироватками хворих на бруцельоз людей (малюнок 4). Значення КП при гострій формі бруцельоз в основному більше 2,0 (середня арифметична - 2,86 ± 0,22), при хронічній формі значення лежать в діапазоні від 1,0 до 2,0 (середня арифметична - 1,53 ± 0, 10). Значення t-критерію Стьюдента: 5,50. Відмінності статистично значущі (р <0,05). Число ступенів свободи f = 23. Критичне значення t-критерію Стьюдента = 2,069.

Мал. 4. Значення КП при різних формах бруцельозу (1-10 - сироватки крові хворих на хронічну форму бруцельозу; 11-24 - сироватки крові хворих на гостру форму)

При випробуванні розроблена тест-система дозволяла виявляти антитіла до збудника бруцельозу при різних формах захворювання. При цьому відзначали негативну реакцію з сироватками крові здорових людей.

висновки

В результаті проведених досліджень розроблена тест-система для виявлення специфічних антитіл до збудника бруцельозу на основі непрямого методу імуноферментного аналізу.

Встановлено оптимальні параметри і умови постановки ІФА з розробленою тест-системою: сенсибілізація планшет розчином поливалентного бруцельозного водорозчинного Аг в 0,1 ФСБ, рН 7,2 ± 0,2 с концентрацією білка 100 мкг / мл протягом 2 год при температурі 37 ° С або 1 ч в умовах термошейкер (250 об / хв; 37 оС); блокування вільних сайтів зв'язування - буферним растворомс 0,1% БСА в присутності неионного детергентадо 0,05%; взаємодія сироваток зі специфічним Аг - 60 хв при 37 ° С; час експозиції з імунопероксидазному кон'югатом - 30 хв при температурі 37 ° С.

Таким чином, результатом проведених досліджень стала розробка тест-системи для виявлення специфічних антитіл до збудника бруцельозу, що дозволяє протягом 3-4 годин (включаючи попередню сенсибілізацію) визначити наявність їх антитіл в сироватках крові хворих на гостру і хронічну форму бруцельозу.

В результаті випробувань встановлено висока активність і специфічність тест-систем для виявлення специфічних антитіл до збудника бруцельозу в сироватках крові людей, що дозволяє запропонувати їх в якості альтернативного тесту в лабораторній діагностиці бруцельозу.

бібліографічна посилання

Курчева С.А., Тюменцева І.С., Афанасьєв Е.Н., Жданова Є.В., Старцева О.Л., Жарникова І.В., Гаркуша Ю.Ю., Семірчева А.А. РОЗРОБКА ДІАГНОСТИЧНОЇ ТЕСТ-СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ СПЕЦИФІЧНИХ антитіл до Збудником бруцельозу У непрямих методів ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 2 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24244 (дата звернення: 08.06.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)