ВПЛИВ ВІНДЕБУРНОЛА НА неврологічного статусу І МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ В ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ЩУРІВ ЗА МОДЕЛІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО алергічного енцефаломієліту

1. бібліографічна посилання

1 Карантиш Г.В. 1 Гафиятуллин Г.Ш. 2 Менджеріцкой А.М. 3 Прокоф'єв В.М. 3 Жукова М.В. 1 Макаров В.А. 4

1 ФГБОУ ВО «Донський державний технічний університет»

2 ФГБОУ ВО «Ростовський державний медичний університет» МОЗ РФ

3 ФГАОУ ВО «Південний федеральний університет»

4 Федеральний дослідний центр «Фундаментальні основи біотехнології» РАН

Проведено аналіз впливу віндебурнола (структурного аналога центрального вазоділататора вінкаміну) на неврологічний статус і морфологічну структуру мозку тварин в моделі експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ). Для оцінки клінічної тяжкості захворювання враховували показники летальності, ваги тіла, неврологічного дефіциту і морфологічні ознаки захворювання ЕАЕ. В результаті моделювання ЕАЕ неврологічний дефіцит встановлений був у 54% імунізованих тварин, які далі увійшли в експеримент. Тяжкість захворювання характеризувалася зниженням ваги і розвитком неврологічного дефіциту; в мозку виявлені вогнища деструкції нервової тканини без проліферації гліальних елементів і геморагічного просочування нервової тканини, повнокров'я судин з лейкостаз і лімфоцитарна інфільтрація. Щодо групи імунізованих пацюків, яким не вводили препарат, на тлі введення віндебурнола в моделі ЕАЕ рівень зниження ваги у тварин був менш виражений, у них не спостерігали важкого паралічу кінцівок, а рівень неврологічного дефіциту був не настільки виражений. Також в умовах введення віндебурнола в мозку тварин з ЕАЕ встановлені вогнищадеструкції нервових волокон з проліферацією клітин нейроглії, дистрофічні зміни нейроцитів з каріолізисом ядер.

модель розсіяного склерозу

віндебурнол

неврологічний дефіцит

морфологія мозку.

1. Szabadi E. Functional neuroanatomy of the central noradrenergic system // J. Psychopharmacol. 2013. Vol. 27. P. 659-693.

2. Kappos L., Radue EW, O'Connor P. et al. A placebo-controlled study of oral Fingolimod in relapsing multiple sclerosis // N. Engl. J. Med. 2010. Vol. 362. P. 387-401.

3. Cohen JA, Barkhof F., Comi G. et al. Oral fingolimod or intramuscular interferon for relapsing multiple sclerosis // N. Engl. J. Med. 2010. Vol. 362. P. 402-415.

4. Groom AJ, Smith T., Turski L. Multiple sclerosis and glutamate // Ann NY Acad. Sci. 2003. Vol. 993. P. 229-275.

5. Centonze D., Muzio L., Rossi S. et al. Inflammation triggers synaptic alteration and degeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis // J. Neurosci. 2009. Vol. 29. P. 3442-3452.

6. Carnevale D., De Simone R., Minghetti L. Microglia-neuron interaction in inflammatory and degenerative disease: role of cholinergic and noradrenergic system // CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 2007. Vol. 6. P. 388-397.

7. Musgrave T., Benson C., Wong G. et al. The MAO inhibitor phenelzine improves functional outcomes in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) // Brain Behav. Immun. 2011. Vol. 25. P. 1677-1688.

8. Polak PE, Kalinin S., Feinstein DL Locus coeruleus damage and noradrenaline reductions in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis // Brain. 2011. Vol. 134. P. 665-677.

9. Polak PE, Kalinin S., Braun D. et al. The vincamine derivative vindeburnol provides benefit in a mouse model of multiple sclerosis: effects on the Locus coeruleus // J. Neurochem. 2012. Vol. 121. P. 206-216.

10. Degano AL, Roth GA Passive transfer of experimental autoimmune encephalomyelitis in Vistar rats: dissociation of clinical symptoms and biochemical alterations // J. Neurosci. Res. 2000. Vol. 59 (2). P. 283-290.

11. Combs DJ, D`Alecy LG Motor performance in rats exposed to severe forebraim ischemia: effect of fasting and 1,3-butanediol // Stroke. 1976. Vol. 7 (5). P. 485-488.

12. Okuda T., Baes AU, Nishijima W., Okada M. Improvement of extraction method of coagulation active components from Moringa oleifera seed // Water Research. 1999. Vol. 33 (15). P. 3373-3378.

13. Simonini MV, Polak PE, Sharp A. et al. Increasing CNS noradrenaline reduces EAE severity // J. Neuroimmune Pharmacol. 2010. Vol. 5. P. 252-259.

Розсіяний склероз - хронічне захворювання центральної нервової системи, яке є найбільш поширеним хронічним неврологічним розладом у молодих людей [1]. В основі його патології лежить запальний процес, що супроводжується демиелинизацией. Вже на ранніх стадіях захворювання у пацієнтів з розсіяним склерозом (РС) спостерігається когнітивний дефіцит. Для лікування хворих з РС за останні три десятиліття використовували різні групи препаратів, що володіють імуномодулюючою дією [2; 3], що пов'язано з тим, що найбільш важливу роль в патогенезі розсіяного склерозу відводять аутоімунним механізмам. При цьому дане захворювання супроводжується також порушенням центральної нейромедіації [4; 5], зміна якої не менш важливо для визначення прогресування захворювання. У тому числі встановлена ​​роль глутамата і норадреналіну в патогенезі розсіяного склерозу, що було також підтверджено на моделі експериментальному алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ). Дана модель найбільш часто використовується при вивченні розсіяного склерозу [6-8]. У моделі ЕАЕ було вивчено вплив структурного аналога центрального вазоділататора вінкаміну віндебурнола на експресію тирозингідроксилази, попередника норадреналіну, в Locus coeruleus. Було висловлено припущення про те, що препарати, подібні віндебурнолу, активуючи норадренергічну медіацію в Locus coeruleus, можуть сприяти зниженню симптоматики розсіяного склерозу [9].

Метою даної роботи було вивчення впливу віндебурнола на гістологічні показники в мозку і неврологічний статус щурів в моделі експериментального алергічного енцефаломієліту.

Методи дослідження

Експерименти на тваринах виконані з дотриманням принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментів або в інших наукових цілях (Страсбург, 18 березня 1986 г.). В експеримент увійшли 3-4-місячні самки безпородних щурів. Усіх тварин ділили на 3 групи: 1 - контрольна група (n = 20); 2 - моделювання ЕАЕ (n = 30); 3 - після моделювання ЕАЕ підшкірно вводили віндебурнол в дозуванні 20 мк / кг з дня перших проявів неврологічного дефіциту протягом наступних 10 діб (до піку клінічних проявів захворювання). Розрахунок дози віндебурнола виробляли шляхом обчислення LD50 для даного виду тварин з кордоном довірчого інтервалу 95%. Матеріалом для імунізації тварин з метою відтворення ЕАЕ служив спинний мозок безпородних білих щурів без неврологічної симптоматики з модифікованим повним адьювантом Фрейнда. Реакцію тварин на введення препарату оцінювали за рівнем прояви неврологічного дефіциту і патоморфологічних змін в головному мозку щурів експериментальних груп на піку гострої фази захворювання. Для оцінки клінічної тяжкості захворювання використані наступні стандартні показники [10], в тому числі загальні (вага тіла, летальність) і показники неврологічного дефіциту:

1. Клінічний індекс, який обчислювали в балах за наступними показниками:

0 балів - немає очевидних клінічних проявів; 1 бал - знижений тонус хвоста; 2 бали - слабкість і легкий параліч задніх кінцівок, перевалюється хода, повільне відновлення положення тіла з положення на боці; 3 бали - важкий параліч задніх кінцівок або всіх; 4 - тетраплегія (параліч чотирьох кінцівок); 5 - агональное стан; 6 - смерть.

2. Оцінку неврологічного дефіциту також проводили з використанням методу [11]. Підсумковий бал за цим методом формується як сума балів в 3 рухових тестах, що визначають м'язову силу, чіпкість-тягу і рівновагу, що дозволяє оцінити функціональний стан екстрапірамідної системи. При цьому 0 балів свідчить про максимальної виразності порушень, а 9 балів - про їх відсутність. Тяжкість неврологічних порушень фіксували на відеокамеру.

Для гістологічного дослідження тварин декапітованих під нембуталовим наркозом (35 мг / кг ваги), тканину головного мозку тварин фіксували в 10% -му нейтральному буферирован формаліні, заливали в парафін, з тканинних блоків готували зрізи товщиною 6-8 мкм, фарбували гематоксиліном і еозином. Пофарбовані зрізи досліджували під світловим мікроскопом з можливістю фотореєстрації. Секції мозку оцінювали незалежно для визначення центрів запалення сліпим методом, без інформації про характер обробки тваринного до умертвіння. Зразки для кожної тварини готували ідентичним чином і визначали ступінь запальної інфільтрації [12]. Обробку фотографій проводили за допомогою програми ImageJ (National Institutes of Health (NIH) http: /rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили з використанням пакета програм Statistica 8.0.

результати дослідження

На першому етапі дослідження оцінювали тривалість латентного, клінічного періодів, а також загальна кількість хворих і важкохворих щурів (в% від числа щурів в групі), середній клінічний індекс на піку захворювання і середній кумулятивний індекс хвороби. Було імунізовані 30 щурів, у 14 з яких виявлено були неврологічні порушення, тобто розвивався ЕАЕ. Відсоток виживання серед хворих щурів склав 86%. Тривалість латентного періоду у хворих тварин в середньому склала 6,5 доби. У цей період тварини не втрачали масу. До імунізації середня вага щурів становив 248 г, до 7-ї доби після імунізації вага захворілих тварин незначно знизився (до 227 г). З 8-х діб після імунізації у хворих щурів спостерігали достовірне зниження ваги (р <0,05), який поступово збільшувався в період ремісії захворювання (з 21 доби після імунізації). До кінця експерименту вага тварин був нижче, ніж в 1-й день імунізації (рис. 1). У гостру стадію захворювання у тварин спостерігали нетримання сечі і неврологічні порушення рухових функцій. Клінічний індекс на піку захворювання (7-20 добу) склав 2,4 ± 0,2 бала.

дні експерименту

Мал. 1. Динаміка ваги хворих щурів

У контрольній групі щурів показники неврологічного статусу були в нормі. У тому числі в тесті на м'язову силу щури утримувалися на дротовому екрані більше 15 з: в середньому 24,7 с. У тесті на рівновагу з використанням дерев'яного стрижня тварини утримувалися більше 30 с (в середньому 47,2 с), а в тесті на чіпкість-тягу тварини демонстрували здатність підтягувати 1 або 2 задні лапки. Час до моменту падіння цих тварин в середньому склало 18,7 с. З цієї неврологічної шкалою щури контрольної групи отримали 8,7 ± 0,3 бала. У контрольній групі щурів в корі великих півкуль і стовбурових структурах головного мозку відзначали слабо виражений перицелюлярний іпериваскулярний набряк, нейроцита і структура нервових волокон були збережені. Незначний перицелюлярний іпериваскулярний набряк є нормою для здорового мозку (рис. 2).

При оцінці неврологічного дефіциту на піку захворювання щурів в моделі ЕАЕ встановлено, що в тесті на м'язову силу щури даної групи утримувалися на дротовому екрані в середньому не більше 6,7 с. Більшість тварин в моделі ЕАЕ прагнули утримати рівновагу шляхом захоплення кінцівками дротяного екрану з двох сторін. У тесті на рівновагу з використанням дерев'яного стрижня тварини в моделі ЕАЕ утримували рівновагу менше 30 с (в середньому 11,3 с). У тесті на чіпкість-тягу щури в моделі ЕАЕ змогли втриматися на мотузці в середньому 3,6 с. 29% хворих щурів після поміщення їх на мотузку не могли втриматися на ній: відразу падали. Сума балів за даною шкалою у щурів в моделі ЕАЕ склала 3,8 бала. Таким чином, імунізація щурів приводила до розвитку вираженої неврологічної симптоматики. При цьому у щурів в моделі ЕАЕ в корі великих півкуль нейроцита були збережені, відзначалася вогнищева периваскулярная інфільтрація лімфоцитами, виражений периваскулярний і перицелюлярний набряк, а також дрібні вогнища дезорганізації нервових волокон.

а

б

Мал. 2. Морфологія тканини мозку щура контрольної групи: а) слабко виражена периваскулярная лимфоцитарная інфільтрація в мозку; б) помірний перицелюлярний набряк. Гематоксилін і міозин об. 40. ок. 10

У стовбурових структурах у щурів в моделі ЕАЕ виявлені нейроцита з вираженими дистрофічними змінами, деякі вакуолізований, дифузно периваскулярний і перицелюлярний набряк, на всьому протязі відзначали великі вогнища дезорганізації нервових волокон і помірну диффузную периваскулярну лімфоцитарна інфільтрацію, в частині судин встановлено лейкостаз (рис. 3) .

Відсоток виживання щурів 3-ї групи склав 100%; динаміка їх ваги в процесі розвитку захворювання представлена ​​на малюнку 4. У гостру стадію захворювання у тварин не було ознак нетримання сечі, але неврологічні порушення рухових функцій зберігалися, але в меншій мірі щодо 2-ї групи тварин. Клінічний індекс на піку захворювання (7-20 добу) у щурів 3-ї групи склав 1,3 ± 0,1 бала: їм був характерний низький тонус хвоста і ознаки слабкості і легкого паралічу задніх кінцівок, у ряду тварин виявлена ​​перевалюється хода, повільне відновлення положення тіла з положення на боці. Але на відміну від щурів 2-ї групи (модель ЕАЕ) важкого паралічу кінцівок у них не спостерігали.

У тесті на м'язову силу щури 3-ї групи утримувалися на дротовому екрані в середньому 16,4 ± 0,7 с, що на 34% (р <0,05) було нижче, ніж у контрольній групі. У тесті на рівновагу тварини 3-ї групи демонстрували збільшення часу утримання на дерев'яному стрижні (в середньому до 23,4 с) щодо щурів 2-ї групи. У тесті на чіпкість-тягу тварини 3-ї групи в середньому утримувалися на горизонтальній мотузці 12,3 с, що на 34% (р <0,05) було нижче, ніж у контрольній групі. Сумарно по неврологічної шкалою тварини 3-ї групи отримали 5,4 бала.

Мал. 3. Морфологічні зміни в тканині мозку щурів в моделі ЕАЕ: а) вогнищадеструкції нервової тканини без проліферації гліальних елементів; б) оболонка головного мозку з набряком, полнокровием і осередкової лімфоцитарною інфільтрацією; в) повнокров'я судин з лейкостаз; г) вогнища геморагічного просочування нервової тканини. Гематоксилін і міозин об. 40. ок. 10.

дні експерименту

Мал. 4. Динаміка ваги щурів при введенні віндебурнола в моделі ЕАЕ

У щурів 3-ї групи були виявлені також вогнища деструкції нервових волокон з проліферацією клітин нейроглії, дистрофічні зміни нейроцитів з каріолізисом ядер, на деяких ділянках виявлена ​​деструкція нервових волокон (рис. 5).

а

б

в

Мал. 5. Морфологічні зміни тканини мозку щурів в моделі ЕАЕ і введення віндебурнола: а) вогнищадеструкції нервових волокон з проліферацією клітин нейроглії; б) дистрофічні зміни нейроцитів з каріолізисом ядер; в) ділянки деструкції нервових волокон. Гематоксилін і міозин об. 40. ок. 10

Щодо щурів 2-ї групи у імунізованих тварин з введенням віндебурнола не встановлена ​​вогнищева периваскулярная інфільтрація лімфоцитами, периваскулярний і перицелюлярний набряк, також лейкостаз судин. Отже, введення віндебурнола знижує дані прояви ЕАЕ.

висновок

Роботи, присвячені вивченню ефектів віндебурнола в моделі ЕАЕ, нечисленні. Встановлені зміни неврологічного статусу і морфологічної картини в мозку у щурів з розвинувся ЕАЕ і при введенні віндебурнола можна пояснити його впливом на норадренергічну нейромедіацію. Зниження рівня норадренергіческого рівня ЦНС і деструктивні зміни нейронів в Locus Coeruleus були описані як в моделі ЕАЕ, так і у пацієнтів з хронічним розсіяним склерозом [7]. При цьому пошкодження Locus Coeruleus сприяє посиленню симптомів при експериментальному аутоімунному енцефаліт, тоді як підвищення рівнів норадреналіну або його попередників в цій структурі мозку пом'якшує перебіг захворювання [13]. Згідно з даними літератури лікування мишей з експериментальним аутоімунним енцефалітом за допомогою віндаміна віндебурнола, що сприяє підвищенню рівня норадреналіну і його метаболізму в Locus Coeruleus, призводить до зниження симптомів даного захворювання [8]. Таким чином, виявлені індикатори, хоча і нечисленні, що показують, що рівень норадреналіну в Locus Coeruleus в моделі розсіяного склерозу знижений, а стимуляція його метаболізму при введенні віндебурнола може поліпшити симптоми даного захворювання. Це побічно підтверджують і результати морфологічних досліджень в мозку щурів, яким вводили віндебурнол в моделі ЕАЕ.

бібліографічна посилання

Карантиш Г.В., Гафиятуллин Г.Ш., Менджеріцкой А.М., Прокоф'єв В.М., Жукова М.В., Макаров В.А. ВПЛИВ ВІНДЕБУРНОЛА НА неврологічного статусу І МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ В ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ЩУРІВ ЗА МОДЕЛІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО алергічного енцефаломієліту // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2018. - № 1 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27398 (дата звернення: 06.11.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)