Імуноферментний аналіз (відбір, зберігання і підготовка проб).

В. Г. Осипова, лікар ветеринарної медицини,

завідуюча лабораторією ВЦ «Алден-Вет»

Імуноферментний аналіз (ІФА, англ. ELISA - Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) - це лабораторний імунологічний метод якісного визначення і кількісного виміру різних хімічних сполук, біологічних об'єктів (вірусів, бактерій, найпростіших і ін.), А також імуноглобулінів, гормонів та інших макромолекул. В основі методу лежить принцип взаємодії імуносорбенту-антигену (наприклад, збудника певної інфекції) з виявляються антитілами. Оскільки антитіла високоспецефічни до відповідних антигенів, то в залежності від того, які антитіла використані, тест-система буде виявляти в досліджуваному зразку або специфічні антитіла незалежно від їх класу, або антитіла лише певного класу. Виявлення утворився комплексу проводять з використанням ферменту в якості мітки для реєстрації сигналу

Метод ІФА має високу чутливість і специфічність, яка в даний час складає більше 90%.

Тест-системи для імуноферментної діагностики виявляють широке коло різних інфекцій: герпесного, токсоплазмової, хламідійної, мікоплазменної та ін.

ІФА дає можливість визначення антитіл (IgG, IgA, IgM) до збудників інфекції в крові. Ці антитіла виробляються імунною системою у відповідь на присутність збудника (антигену) в організмі.

Завдяки тому, що імуноглобуліни різних класів виробляються в певній послідовності, за допомогою ІФА можна діагностувати інфекцію на різних стадіях, і відслідковувати динаміку розвитку процесу.

Також ІФА широко застосовується для діагностики патологій ендокринної системи.

Матеріалом для дослідження служить сироватка або плазма венозної крові, взятої натщесерце.

Умови взяття крові та її зберігання до початку лабораторних досліджень мають важливе значення для отримання достовірних результатів. Багато в чому ці результати залежать від техніки взяття крові і використовуваних при цьому інструментів. При заборі крові для аналізу прокол оточуючих вену тканин і стінки судини роблять в один прийом. Голки для взяття крові повинні бути з коротким зрізом і досить великим діаметром, щоб не травмувати протилежну стінку вени і не викликати пошкодження еритроцитів. Кров повинна стікати по стінці пробірки, щоб уникнути руйнування еритроцитів.

Залежно від характеру досліджень готують певну кількість пробірок. Стінки скляного посуду здатні обмінюватися іонами з кров'ю, а сліди миючих засобів та пошкоджені пробірки впливають на активність гормонів, ферментів. Це можна виключити, якщо застосовувати пластикові пробірки одноразового використання. Залежно від завдань дослідження аналізу піддають цільну кров, плазму або сироватку.

Для отримання сироватки, пробірки з кров'ю рекомендується в процесі взяття крові поміщати в термостат з температурою до 38 ° С. Цільну кров, плазму і сироватку для нетривалого зберігання поміщають в холодильник (+ 2 + 4 ° С), тривале зберігання сироватки вимагає заморожування і зберігання при температурі -20 ° С.

Порушення умов зберігання проб може стати причиною похибок аналізу. В результаті тривалого стояння сироватки, над еритроцитами можуть наступити зрушення в концентрації ряду компонентів. Невміле струшування проб при перемішуванні їх вмісту або при транспортуванні також може викликати гемоліз еритроцитів.

Помилки, що виникають на внелабораторних етапі аналізу, складають, в середньому, від 70% до 95% всіх похибок, які допускаються при проведенні аналізу. Саме вони можуть виявитися непоправними і повністю знецінити весь хід проведених досліджень і їх результати.

При отриманні, обробці та доставці зразків в лабораторію слід мати на увазі наступні чинники, які можуть бути як усунути, так і усунути.

Циркадні ритми зміни концентрації гормонів у досліджуваного тваринного, найбільш яскраво виражені для кортизолу, адренокортикотропного гормону (АКТГ), альдостерону, пролактину, соматотропного гормону (СТГ), реніну, тиреотропного гормону (ТТГ), паратгормону, тестостерону. Відхилення концентрацій від середньодобових значень можуть досягати 50% -400% і цей фактор обов'язково повинен прийматися до уваги. Наприклад, добове коливання (циркадний ритм) рівня кортизолу може бути причиною недостовірних результатів тесту на толерантність до глюкози, якщо він проводиться в другій половині дня.

Для того щоб не ускладнювати процес інтерпретації результатів, відбір проб для аналізу потрібно проводити строго в певний час доби, зазвичай між 9 і 11 годинами ранку.

При проведенні спеціальних досліджень, наприклад, при встановленні індивідуального циркадного ритму секреції гормону, протягом доби відбирається кілька проб аналізованого матеріалу. У документах, що супроводжують такі зразки, необхідно вказати точний час взяття кожного з них.

У деяких випадках слід враховувати сезонні впливи. Наприклад, зміст трийодтироніну (T3) в сироватці (плазмі) крові на 20% нижче влітку, ніж взимку.

Фізичні і стресові навантаження роблять значний вплив на зміст таких гормонів, як кортизол, тестостерон, АКТГ, ангіотензин, альдостерон, ренін, пролактин, СТГ, ТСГ, міоглобін, катехоламіни, вазопресин і ін.

При аналізі гормонів, концентрація яких може швидко змінюватися протягом доби, наприклад, тестостерону, рекомендується використовувати змішану пробу, отриману з трьох зразків сироватки (плазми) крові, відібраних з інтервалом в кілька годин.

Діагностичні та лікувальні процедури, такі як оперативне втручання, внутрішньовенні вливання, пункції, біопсії, функціональні тести часто впливають на результати лабораторних досліджень. Для виключення цих чинників відбір зразків крові рекомендується проводити до виконання будь-яких лікувальних і діагностичних процедур.

Прийом лікарських препаратів може відображатися на кількісний вміст в організмі цілого ряду аналізованих показників. Наприклад, рівень ТТГ знижується при лікуванні допаміном, концентрація спільних і вільних фракцій тиреоїдних гормонів (Т3, Т4) змінюється при введенні фуросеміду, даназола, аміодарону і саліцилатів, а застосування деяких противиразкових препаратів може підвищувати рівень пролактину.

Присутність лікарських препаратів в біологічному матеріалі, наприклад, саліцилатів, андрогенів і ін., Може специфічно (перехресна реакція) або неспецифически впливати на результати лабораторних досліджень при визначенні концентрації стероїдних і тиреоїдних гормонів, а також специфічних зв'язуючих білків крові. Тому проведення медикаментозної терапії, що може спотворювати результати аналізу, слід призначати після взяття проб крові.

Повторні взяття проб крові широко використовуються в динамічних дослідженнях, наприклад, при проведенні стимуляційних тестів, для оцінки ефективності проведеного лікування, при прогнозуванні результату захворювання, при лікарському моніторингу, а також в цілому ряді інших випадків.

Цей же принцип використовується при діагностиці та лікуванні інфекційних захворювань - виявлення специфічних антитіл до збудника і динаміка їх рівнів в ході лікування.

Гемоліз і ліпемія проб є факторами ризику, здатними знижувати достовірність результатів аналізу. Це пов'язано з тим, що в клітинах крові міститься у високій концентрації цілий ряд компонентів, які визначаються в сироватці або плазмі. При гемолізі вони можуть вивільнятися в аналізовану пробу і змінювати її склад, ускладнюючи інтерпретацію результатів дослідження.

Каламутні зразки з підвищеним вмістом ліпопротеїнів і тригліцеридів не рекомендується використовувати в якості аналізованого матеріалу.

Зі спеціальних рекомендацій слід зазначити, що при заборі крові для визначення АКТГ рекомендується використовувати пробірки з полістиролу, оскільки скло адсорбує цей гормон.

Правильна і чітке маркування пробірок є дуже важливим моментом, так як дозволяє виключити плутанину при ідентифікації тварин, запитів на проби, самих проб та результатів досліджень.

Підготовлений і промаркірований біологічний матеріал повинен бути, як можна швидше доставлений в лабораторію. Слід мати на увазі, що упущення при транспортуванні, що порушують безпеку проб, унеможливлюють правильне визначення шуканого об'єкта в пробі.

Для пересилання проб слід використовувати герметично закриваються пробірки з інертного не б'ється. Пробірки повинні бути поміщені в спеціальний контейнер з абсорбентом, який знижує ризик протікання при будь-якому механічному пошкодженні і забезпечує необхідні заходи безпеки. При транспортуванні охолоджених або заморожених зразків рекомендується використовувати теплоизолирующий контейнер з пінопласту, в який можна помістити сухий лід або охолоджуючі елементи. Істотним вимогою є надійна упаковка проб, з тим, щоб забезпечити їх збереження в процесі доставки.