Метаболічна регуляція, або як бактерії говорять один з одним

Метабіотікамі називають препарати нового покоління, які допомагають кишкової мікрофлори правильно виконувати свою роботу. Вони підтримують корисних бактерій і виганяють небезпечних і марних чужинців - в цьому сенсі метабіотікі схожі на пробіотики, тільки діють набагато ефективніше і притому ніяких бактерій в собі не містять. У чому ж тоді їх секрет?

Метаболіти усередині клітин

Патогенні бактерії (жовтим), посипаних кишковий епітелій миші. (Фото: UMHealthSystem / Flickr.com .)

Шлунково-кишкові бактерії групи Bifidobacterium. (Фото: Mediscan / Corbis.)

Кишкова паличка, одна з найзнаменитіших бактерій в світі. (Фото: Phil Moyer / Flickr.com .)

<

>

Тим, хто знайомий з основами біології, термін «метаболічна регуляція» інтуїтивно здається цілком зрозумілим: в живих клітинах протікають біохімічні реакції, в ході яких утворюються метаболіти - результат перетворення одних речовин в інші. Метаболіти, в свою чергу, впливають на біохімічні процеси, і не тільки на «свої» ферменти, але і на ті, що зайняті в інших реакціях. Все це можна було б назвати метаболічної регулюванням, однак стосовно до внутрішньоклітинних процесів термін «метаболічна регуляція» малоконструктівен: всередині клітин більшість процесів так чи інакше регулюються метаболітами, і немає сенсу зайвий раз це підкреслювати.

Академік С.С. Шварц, який запропонував термін «метаболічна регуляція» в 70-і роки минулого століття, грунтувався на експериментах з водними тваринами, і мав на увазі, звичайно, не ті метаболіти, які залишаються всередині клітин, а ті, які виділяються в навколишнє середовище і які до того ж не є феромонами або іншими спеціалізованими сигнальними молекулами. Тобто, коли ми говоримо про метаболічну регуляції, то маємо на увазі не внутрішньоклітинні процеси, а то, що відбувається на більш високому ієрархічному рівні - процеси міжклітинної комунікації в тканинах і органах, одноклітинних і багатоклітинних організмів, тварин і рослин. Охопити настільки великий матеріал в порівняно невеликій статті, безумовно, не вдасться, так що ми постараємося більш-менш докладно описати лише мікробіологічний аспект метаболічної регуляції.

Дивно було б зайвий раз говорити про те, що популяція бактерій починається з бактерій. Однак скільки повинно бути «батьків-засновників» - один, два, десять? Насправді, в більшості випадків для того, щоб популяція почала рости, недостатньо жодної клітини, ні десяти, ні навіть сотні.

Для нормальної кишкової палички (Escherichia coli), якщо її вирощують в простій живильному середовищі, в якій є тільки глюкоза і мінеральні солі, щільність бактерій-«першопоселенців» повинна складати, як правило, не менше 104-105 клітин в мілілітрі - інакше зростання не почнеться, і культура дуже скоро загине. Чому так відбувається? Адже якщо говорити про бактеріях кишкової палички, кожна з них здатна сама синтезувати всі необхідні для життя речовини, були б тільки глюкоза з солями - навіщо ж їй потрібні сусіди? І все ж сусіди необхідні, і це стосується не тільки бактерій, але і інших мікроорганізмів, в тому числі і дріжджів, з яких, власне, і почалася історія метабіотіков і метаболічної регуляції.

Студент Льовенського університету

Вперше на особливості колективної поведінки дріжджів звернув увагу ще Луї Пастер. У роботі «Мемуар про спиртовому бродінні» він зазначав, що дріжджі не можуть рости в чистій або цукрової воді, якщо їх дуже мало, однак починають розмножуватися, якщо щільність засіву збільшити. Ці результати, однак, в той час залишилися без уваги, і систематичне вивчення феномена почалося тільки в 1901 році з експериментів студента 3 курсу Льовенського університету Вільде, який працював під керівництвом професора М. Іде.

Сам Вільде, отримавши медичну освіту, науковою роботою більше не займався і незабаром трагічно загинув під час ліквідації епідемії скарлатини, і розпочате дослідження продовжив Іде. Як і Пастер, Іде і Вільде виявили, що після засіву клітини виділяють в середу певні речовини, які сприяють їх росту і бродінню, але до того ж не є основними джерелами азоту або вуглецю. Комплекс цих речовин отримав умовну назву «біос».

На бактеріях аналогічні експерименти приблизно тоді ж провів Отто Ран, який також прийшов до висновку, що швидкість їхнього росту залежить від концентрації якогось термостабильного речовини, що виділяється в середу самими бактеріями. Чим вище була концентрація клітин, тим швидше воно накопичувалося в середовищі після їх засіву і, отже, тим швидше культура починала рости. Слідом за Іде і Вільде Ран назвав цю речовину «біос». Незабаром схожі результати отримали і інші видатні вчені того часу. Роботи, ініційовані експериментами Вільде, в кінцевому підсумку призвели до відкриття вітаміну біотину (В7), названого так за співзвучністю із «біос». Ця знаменна відкриття відсунуло на задній план вихідну проблему автостімуляціі зростання. Відразу після дослідів Рана були зроблені спроби ідентифікувати склад «биоса», проте всі вони виявилися невдалими - інтерес до проблеми автостімуляціі зростання практично пропав і знову відновився тільки в 50-х роках минулого століття ...

Нова хвиля

Нові дослідження на цю тему почалися з спостереження, що не має до неї безпосереднього відношення. У 50-60-ті роки минулого століття біологи випадково виявили, що при автоклавуванні розчинів глюкози в фосфатному буфері, коли глюкоза руйнується під дією температури, виходять речовини, що стимулюють ріст бактерії Bacillus globigii. Надалі з'ясувалося, що аналогічним чином на зростання мікроорганізмів впливають фільтрати їх культуральних рідин (тобто того середовища, в якій росли бактерії). Майже через десять років група російських дослідників незалежно виявила ефект автостімуляціі зростання в експериментах з бактеріями клостридиями і ешеріхіями. Однак, незважаючи на велику кількість проведених дослідів, природа діючих речовин залишилася нез'ясованою. Остання невдала спроба ідентифікації речовин «біос» відбулася вже в нашому столітті, в 2001 році в лабораторії відомого британського біохіміка Дугласа Келлі.

Однак, навіть якщо ми не знаємо природу речовини і механізм його дії, то використовувати його на практиці це зазвичай не заважає. Так вийшло і з роботами Вільде і Рана: результати їх експериментів знайшли застосування на практиці задовго до ідентифікації речовин «біос».

«Біос» в біотехнології

Ось, наприклад, питання: що робити біотехнології або мікробіологові, якщо потрібні йому бактерії відмовляються рости? Перш за все, згідно з результатами Вільде і Рана, слід збільшити кількість засіваються клітин або засівати ту ж кількість бактерій, але зменшити обсяг культурального середовища. Чим більше виявиться бактерій в одиниці об'єму, тим швидше вони наситять середу речовинами «біос» і тим швидше приступлять до зростання.

Але є інший спосіб - додати в середу загадковий «біос» і вирощувати бактерії, не піклуючись про щільність їх засіву. Досліди Вільде і Рана і деяких їхніх послідовників показали, що в якості джерела «биоса» можна використовувати стару «виснажену» середу, ту, яку раніше просто зливали в відходи. Добавки на основі культуральної рідини, що містять «біос», дозволяють на 15-20% підвищити вихід біомаси бактерій у великих промислових биореакторах (ферментерах), допомагають скоротити час культивування, зменшити витрату поживних речовин, енергії і кількість відходів. Здавалося б, небагато, проте при промисловому виробництві навіть підвищення виходу біомаси на 10% при одночасному скороченні виробничого циклу, а також потреб у сировині і воді приносить відчутну економію.

Шлунково-кишковий тракт людини, по суті, являє такий же біореактор, як і промисловий ферментер, але тільки більш ефективний. Досить сказати, що щільність мікроорганізмів в ньому досягає фантастичного значення - 1011-1012 клітин мікроорганізмів на мілілітр вмісту, тоді як в промислових реакторах їх концентрація на 1-2 порядки нижче. Крім того, кишечник являє собою реактор проточного типу. Це означає, що на вході в нього практично постійно подаються поживні речовини, які переробляються мікроорганізмами, а продукти переробки надходять в організм господаря. Експерименти з проточними реакторами показали, що культура в них дуже швидко змінюється, і через 2-3 тижні культивування в такому реакторі залишаються тільки найбільш швидкозростаючі клітини, а ті, що розмножуються повільніше, з реактора просто вимиваються. При цьому неважливо, чи живуть в реакторі однакові або різні бактерії; в будь-якому випадку, з них залишаються тільки самі «плодовиті» мікроорганізми. Відбувається так звана селекція на протоці, по суті подібна селекції, здійснюваної людиною для отримання найбільш плідних тварин або рослин.

Ми всі знаємо про пробіотики - бактеріальних препаратах, які з часів І.І. Мечникова використовуються в якості лікувально-профілактичних препаратів для нормалізації (оптимізації) мікрофлори людини. Але в процесі приготування і зберігання прибутків їх бактерії пошкоджуються і, крім того, переходять з активного в пасивний (покоїться) стан. І тому ефект селекції на протоці, який має місце в кишечнику, сильно обмежує потенціал пробіотичних бактерій - вони просто не встигають затриматися в шлунково-кишковому тракті. Щоб знову перейти до активного розмноження, відновити свої фізіологічні функції, адаптуватися до умов середовища і, в кінцевому підсумку, прижитися в кишечнику, їм необхідний якийсь поштовх. Таким поштовхом якраз і може стати «біос».

Актофлор - активатор мікрофлори

Ось так завдяки відкриттям початку ХХ століття виникла ідея метабіотіка - препарату на основі комплексу «біос», який підвищував би активність мікроорганізмів в пробіотичних препаратах. Але не тільки в них. За сучасними даними, людський організм населяють від 1000 до 2000 різних видів мікроорганізмів. Рідкісний науково-дослідний інститут може похвалитися такою колекцією! Деякі бактерії мікробіоти кишечника активно розмножуються в ньому, а деякі просто існують, непомітно облаштувавшись в складках пристінкового простору кишки. Досить імовірно, що серед них чимало і цілком корисних, але тільки проявити свій потенціал у них не виходить через надмірне зростання інших бактерій. Щоб протистояти розмножити сусідам, їм не вистачає особливого сигналу, тобто все того ж «биоса».

Для оптимізації складу мікрофлори «біос» можна було б додавати в їжу, але для цього треба вирішити дві проблеми: де знайти відповідний «біос» і як його отримувати в промислових масштабах. Вимоги до препарату досить очевидні: висока активність, мінімальний вміст сторонніх речовин, безпеку для людини і, нарешті, рентабельність виробництва.

Ми в лабораторії мікробіології Державного науково-дослідного інституту особливо чистих біопрепаратів в Санкт-Петербурзі припустили, що для отримання «біос», що відповідає всім необхідним умовам, як не можна краще відповідає штам бактерій Escherichia coli М-17. Люди старшого покоління, можливо, ще пам'ятають препарат колибактерин, що випускався як раз на основі М-17. Зараз він майже забутий, але був час, коли колибактерин був єдиним на території СРСР пробіотичним препаратом. Для багатьох малюків і навіть для літніх людей він став рятівним препаратом, який, втім, за часів загального дефіциту дістати було зовсім не просто. (До речі, штам E.coli М-17 відкрив російський і радянський мікробіолог Леопольд Генріхович Перетц (1891-1961), і він же в 1930 році вже успішно використовував цей штам у медичних цілях.)

При звичайних умовах зростання культуральна рідина E. coli М-17 містить не так багато активних речовин, як хотілося б. В результаті численних експериментів умови культивування вдалося змінити таким чином, щоб активність культуральної рідини збільшилася в десятки разів. Щоб отримати «біос», з неї видаляють бактерії і практично всі високомолекулярні речовини, потенційно небезпечні для людини. Отриманий таким чином препарат не тільки ефективно стимулює зростання самого бактеріального штаму, а й підвищує його здатність пригнічувати ріст бактерій-«чужаків», як патогенних, так і просто тих, що не входять до складу мікробіоценозу людини. Більш того, виявилося, що «біос» E. coli М-17 активно стимулює такі ж властивості у інших представників нормальної мікрофлори, таких, як біфідобактерії і лактобацили. Що ж до «чужинців», то на них він в цьому сенсі майже не діє. Таким чином, в наших руках опинився препарат, вибірково стимулює ріст бактерій нормальної мікрофлори людини. Його назвали «Активатором мікрофлори», згодом - Актофлор.

У читача майже напевно виникне питання: «Чому Актофлор ​​стимулює зростання тільки представників нормальної мікрофлори? Як саме він дізнається, де своя бактерія, а де чужа? »Відповіді, як не дивно, значно простіше, ніж могло б здатися. Вся справа в тому, що E. coli - чи не перша бактерія, заселяють кишечник новонародженого. В її завдання входить впорядкування нового середовища існування і забезпечення всіх необхідних умов для «приживлення» інших бактерій, і свій «біос» вона виробляє саме для цього. Без кишкової палички і її «биоса» інші бактерії ніяк не змогли б прижитися в кишечнику. З іншого боку, мільйони років еволюції дозволили нашим бактеріям знайти спільну мову, і «біос» кишкової палички - як раз результат довгої взаємної притирання різних мікробів один до одного.

Актофлор-С - синтетичний аналог Актофлора

Чи можна створити штучний аналог Актофлора, якщо ми дізнаємося, з чого він складається? За попередніми оцінками, він містить більше ста з'єднань, з яких майже сорок вдалося ідентифікувати з використанням різних хроматографічних і спектральних методів. Практично всі вони виявилися добре відомими і цілком доступними речовинами, які можна придбати у фірм виробників реактивів, а потім змішати в потрібній пропорції і отримати якусь модель культуральної рідини бактерій. Що і було зроблено. На превеликий подив, перший же експеримент показав, що штучно створена суміш володіє практично тієї ж біологічну активність, що і сама культуральна рідина!

Але для повної впевненості потрібно було порівняти кілька різних препаратів «натурального» Актофлора з їх же штучними аналогами. Якби виявилося, що зміни в активностях у тих і інших збігаються, то наявність однозначного зв'язку між складом і активністю можна було б вважати доведеною.

Складати композиції з сорока речовин - завдання досить трудомістка і невдячна, тому, перш ніж проводити основні експерименти, мало сенс переконатися в необхідності тих чи інших сполук. Для цього вивчали індивідуальну активність кожного з'єднання і їх різних поєднань, потім їх окремо і групами виключали зі штучної суміші, порівнюючи її активність з активністю вихідного препарату. В результаті кількість необхідних компонентів зменшилася всього до 16-18 речовин. Надалі порівняння десяти «натуральних» (тобто отриманих при культивуванні бактерій) препаратів Актофлора з штучними сумішами показало, що між активністю і складом дійсно є чітка кореляція.

В принципі, розробку препарату на цьому можна було б і закінчити. Однак виникла думка обігнати природу - тобто шляхом підбору оптимальних співвідношень концентрацій компонентів отримати ще більш активний препарат. На перевірку ця ідея виявилася дуже плідною: активність в результаті вдалося підвищити практично в десять разів. Кінцевий варіант містив не сорок і не шістнадцять, а всього 12-13 основних з'єднань.

Таким чином, в результаті проведеної роботи було створено абсолютно новий препарат, названий Актофлор-С (Актофлор ​​синтетичний), заснований на концепції бактеріального «біос» і не має аналогів в світі. Залишалося тільки випробувати його в експериментах на тваринах і в клінічній практиці, попередньо переконавшись в його безпеці. Втім, сумнівів з приводу безпеки не було, так як Актофлор, прототип Актофлор-С, з цього приводу вже перевіряли, і він виявився повністю безпечним.

У висновку Інституту токсикології Міністерства охорони здоров'я Росії щодо безпеки та фармакологічної активності Актофлора-С йдеться, що він малотоксичний, має великою широтою терапевтичної дії і безпечний при тривалому введенні експериментальним тваринам. При внутрішньошлунковому введенні препарат не викликає подразнюючої ефекту і не провокує розвитку алергічних реакцій, має імуномодулюючу дію і не робить негативного впливу на репродуктивну функцію. У тварин з дисбактеріозом і виразкою шлунка препарат допомагав швидко відновити склад мікрофлори і приблизно в два рази прискорював загоєння виразкових ураження. Останнє здалося авторам виключно важливим, адже це означало, що суміш бактеріальних метаболітів позитивно діє не тільки на мікрофлору, але і безпосередньо на організм господаря. Додаткові експерименти з культурами тканин тварин і людини показали, що Актофлор-С дійсно стимулює зростання і розмноження клітин імунної тканини і кишкового епітелію.

При подальшому вивченні з'ясувалося, що Актофлор-С володіє практично тими ж властивостями, що і його прототип Актофлор, але при цьому він набагато ефективніше, тобто надає той же ефект, але при істотно більш низьких концентраціях. Мало того, виявилося, що препарати бактеріальних метаболітів при лікуванні можуть використовуватися подібно до антибіотиків. В експериментах з мишами, зараженими бактеріями сальмонелами, Актофлор-С сам по собі і разом з пробіотиками підвищував виживаність тварин. (Причому слід зазначити, що самі по собі пробіотики, нехай і зарекомендували себе як хороші відновники мікрофлори людини, від інфекції захищали слабо - миші гинули в безлічі.)

Експерименти на тваринах дозволили перейти до клінічних випробувань. Ще до розробки Актофлор-С, його прототип, Актофлор, успішно застосовували в Військово-медичної академії для нормалізації мікрофлори кишечника після використання антибактеріальних препаратів. Сам Актофлор-С вивчався в педіатричному відділенні ДГБ №1 Санкт-Петербурга. У дослідженні брали участь пацієнти від 11 до 18 років, хворі на пневмонію. Всі вони отримували антибактеріальну терапію, через яку страждала нормальна мікрофлора кишечника. При використанні ж Актофлора-С у пацієнтів підвищувалася частка біфідобактерій, лактобактерій і типовою кишкової палички, а ось «неправильні» штами кишкової палички, навпаки, з кишечника йшли. Крім того, у хворих при прийомі Актофлора-С підвищувався рівень імуноглобуліну А в слині - тобто присутність метабіотіка в схемі лікування стимулювало і нормальну мікрофлору, і імунітет.

Оскільки в Актофлоре-С немає мікробів, а є тільки хімічні речовини, які вони виділяють, його можна приймати хворим, у яких погано працює імунітет. З Актофлором-С немає небезпеки, що він створить зайве навантаження на ослаблену імунну систему, тоді як з мікробними пробіотиками є ризик, що їх мікроби проникнуть у внутрішнє середовище організму.

Що таке надійність?

Ми говорили про те, що Актофлор-С - багатокомпонентний препарат. Якщо видалити з нього будь-якої компонента, надійність його дії знизиться. Що це означає? Вся справа в тому, що кожен компонент препарату діє не на всю популяцію бактерій відразу, а на якийсь обмежене коло. Схожим чином йдуть справи і з іншими медичними препаратами: при їх випробуванні часто виявляється, що на кого-то вони або не надає належної дії, або взагалі викликають протилежну реакцію. І, коли говорять про надійність препарату, то мають на увазі, що він діє, як треба, на велику групу людей.

Мікробна популяція точно так же неоднорідна по реакції на компоненти «биоса». Склад популяції мікробів легко змінюється в залежності від умов їх вирощування і ряду інших чинників. В результаті ті речовини, які максимально стимулювали зростання всієї популяції сьогодні, завтра можуть виявитися менш ефективними. Основна перевага многокомпонентного препарату, такого як Актофлор-С, перед можливими аналогами з меншою кількістю інгредієнтів якраз і полягає в тому, що Актофлор-С стимулює розвиток пробіотичних бактерій при самих різних умовах.

Інтерес до метабіотікам як до препаратів нового покоління, стає дедалі більше, а це значить, що в найближчому майбутньому ми дізнаємося про них багато нового. Що до Актофлора-С, то його з минулого року вже можна знайти в аптеках Санкт-Петербурга і деяких інших міст.

Доктор біологічних наук Тимур Вахитов, Державний науково-дослідний інститут особливо чистих біопрепаратів, Санкт-Петербург.

На правах реклами.