67 гостей
Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry
Підшлунковий мезенхіми потрібно під час розвитку і дорослому житті. Описаний тут метод дозволяє ізолювати мезенхімальних клітин з ембріональних, новонароджених і дорослих підшлункової залози. Мезенхімальні клітини, але ніякі інші типи клітин, висловлюють жовтий флуоресцентний білок (YFP) в підшлунковій залозі Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP мишей 5,11,17,19. Під час розробки, Nkx3.2 (також відомий як BapX1) виражається ембріональної підшлункової залози, шлунка, кишечника і мезенхіми, а також в підгрупі скелетної сомітов 19,20,21. Не було висловлено Цей ген в підшлунковій мезенхіми від E9.5 до E11.5, дозволяючи експресію гена під контролем Nkx3.2 -Cre від E9.5 5, р> 19,20. На основі цього маркування, клітини можуть бути очищені з об'ємною тканини підшлункової залози з використанням проточної цитометрії. На малюнку 2 показаний аналіз проточної цитометрії окремих клітин з ембріональних, неонатальних та дорослих тканинах підшлункової залози, виділені, як описано тут. У той час як нетрансгенние панкреатичні тканини не містять флуоресцентні клітини, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP тканини підшлункової залози з усіх проаналізованих віку містить яскраво виражений YFP мічених популяції клітин (рисунок 2, відмічені воротами).
Слідуючи методиці, описаній тут, клітини, які експресують флуоресцентні білки можуть бути або очищені або проаналізовані за допомогою проточної цитометрії, з або без додаткового імунозабарвлення. Наприклад, після того, як сортування заснована на флуоресцентного мічення, мезенхімальні клітини можна культивувати створити клітинну лінію (по крайней мере, п'ять проходів), як показано на фігурі 3А. Примітка т він fibrocytic морфології культивованих клітин, характерних для клітин мезенхіми. Крім того, ця система була використана для аналізу експресії генів, відсортованих клітин. З цією метою, РНК екстрагували з відсортованих клітин мезенхіми синтезувати кДНК, і рівні експресії генів були проаналізовані за допомогою КПЦР. Такий аналіз показав, що відсортовані клітини експресують пан-мезенхімальних маркера виментин (рис 3B). Нарешті, експресія маркерів поверхні за допомогою панкреатичних клітин можуть бути проаналізовані за допомогою проточної цитометрії. Наприклад, ми виділили клітини з підшлункової залози тканини Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP дорослих мишей, використовуючи метод, описаний тут, і фарбують їх з поверхнею клітини глікопротеїну CD9, про який повідомлялося, експресується фибробластами 22. Як показано на фіг.3С, все флуоресцентно мічених клітин в Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP підшлункової залози висловити CD9.
tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Малюнок 1: Ембріональні і неонатальної тканини підшлункової залози. Ізольовані весь шлунково - кишкового тракту, в тому числі шлунка, селезінки, кишечника та підшлункової залози, як E15.5 ембріона (А) і Р4 дитинча (B). Тканини підшлункової залози розмежовані з синьою лінією. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 2: мезенхімальні клітини флуоресцентно мічених в Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP тканини підшлункової залози. Flow-цитометрії аналіз панкреатичних клітин, виділених з не-трансгенної (зліва панелі) і Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP трансгенна (права панель) мишей різного віку: ембріональна (А), неонатальної (B), і об'явленіящ (С). Клітини аналізували на вміст бічного розсіювання (Y-вісь) і жовтої флуоресценції (вісь х). Ворота (відмічені "D") вказує на наявність популяції YFP + клітин у трансгенних мишей, але не в нетрансгенним контролем. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 3: Аналіз ізольованих клітин підшлункової залози. (А) Клітини, відсортованих з тканини підшлункової залози з Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP неонатальної мишей (як описано на фігурі 2В) культивували створити клітинну лінію. Культивовані клітини були обстежені для флуоресценції (зелені, правої та лівої панелей) і фазового контрасту (сірий колір, права панель). (B) Bar діаграма, що показує Vimentin1 (Vim1) Рівні експресії по YFP + -sorted клітин з тканини підшлункової залози з Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP дорослих мишей (як описано на малюнку 1C, зелений) в порівнянні з несортоване тканини підшлункової залози (чорний). РНК екстрагували, і експресія гена аналізували за допомогою КПЦР; вираз нормалізувався циклофіліном. N = 4. *** Р <0,001. Дані являють собою середнє ± стандартне відхилення. (C) Flow-цитометрії аналіз розосереджених клітин підшлункової залози з Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP дорослих мишей імуно-офарблювалися аллофикоцианин (APC) -conjugated анти-CD9 антитіла і аналізували на APC (вісь у) і жовтої флуоресценції (вісь х). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
