67 гостей
Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags
Перший центрифугування в градієнті щільності з використанням Ficoll дає білий інтерфазу містить МНПК (Малюнок 1A) тобто лімфоцити і моноцити. Це може бути підтверджено через фарбування травня-Gruenwald (Цифри 1B і C) із зібраних клітин, який показує як високу ядра / співвідношення цитоплазми (типових лімфоцитів) і bean- або кільцеподібні ядра (типовий моноцитів). Коли ці клітини потім завантажували на другому градієнті щільності з використанням Перколла, моноцити можуть бути далі відокремлена від лімфоцитів і знову з'являється у вигляді білого інтерфази (Фігури 1D-F). Для кожного лейкоцитарної плівки описано двічі градієнт щільності центрифугування зазвичай дає 150 ± 40 x 10 6 моноцити, які можуть бути диференційовані в 70 ± 30 x 10 6 макрофагів (малюнок 2) в лейкоцитарної плівки. Середній макрофагів вихід із20 незалежних препарати був 47 ± 14% від загального обсягу виділених моноцитів.
Після центрифугування в градієнті Перколла там ще може бути деяка кількість залишкових моноцитарні клітини, присутні в підготовці, яка залежить від донора крові, а також від точності в процесі виділення. Проте, після диференціювання фази 6-7 днів, підготовка в основному складається з зрілих макрофагів (рисунок 3), які можуть бути додатково збагачених за їх дотриманням пластикових поверхонь, особливість, яка не поділяє випадкових забруднюючих клітин (Малюнки 4A і В). Після покриттям, більшість з макрофагів показати класичне "смаженим яйцем" морфологію, а є і клітини з розтягується шпинделя як фенотипу (рис 4 ° С і D). Це відбивається на їх F-актин розподілу в цитоплазмі і адгезії кластерів. Диференційовані клеткіхарактерізуются виразом CD45, CD14, CD16, CD206 (манноза рецепторів), CD11b і CD11c, характерні маркери для зрілих макрофагів (малюнок 5). Наявність CD11b виступає проти переважно дендритних диференціації, яка спирається на той факт, що клітини негативні для дендритних клітин маркера CD209 (DC-SIGN).
Після процесу диференціювання клітини залишаються функціонально і метаболічно активними протягом приблизно 5-7 днів (малюнок 6), як це може бути, візуалізованими за допомогою Кальцеін AM фарбування і їх здатність поглинати позаклітинних бульбашки пролити від пухлинних клітин. Крім того, клітини все ще можуть бути активовані, як показано, наприклад, на стимуляції ліпополісахаридом (ЛПС), що призводить до експресії декількох прозапальних генів (фіг.7).
Малюнок 2 Прибутковість моноцитів і макрофагів. Представництва стільникові Підрахунки ізольованих моноцитів і макрофагів з 20 поглинає покриття прeparations.
Рис.3 Мікрофотографії і вимірювання розмірів клітин з моноцитів і макрофагів. Фаза контрастної мікроскопії моноцитарних клітинної суспензії до (А) і після (б) макрофагів диференціації. Відповідний розмір осередку гістограми моноцитів (C) і макрофагів (D). Шкала бар = 100 мкм.
Малюнок 4 Морфологія і організації цитоскелету прилипають КПЕ. Фаза контрастної мікроскопії прилипають КПЕ до (А) і після (Б) видалення не-adherenТ-клітини. (С, D) фаллоідін-TRITC фарбування нитчастих актину в адгезивних, нестимульований макрофагів. Шкала бар = 100 мкм в КК, 20 мкм в D. Натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 5 імунофенотипу диференційованих макрофагах. Проточної цитометрії аналізу макрофагів після 6 днів диференціації в FEP з тефлоновим покриттям для культивування клітин мішки (позначена червоним). Відповідні управління ізотипних виділені сірим кольором. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 6 Поглинання пухлинних клітин микровезикул макрофагами.
Мікрофотографії прилипли макрофагів після експозиції до PKH26-мічених клітин, отриманих микровезикул (червоний флуоресцентний) пухлин. Зображення накладається на відповідний (A) світлого або (б) цитозольного фарбування з барвником кальцеіна AM життєздатності. Шкала барів = 100 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 7 Що підвищує регуляція IL-1 β, Wnt5a, TNF, IL-6, ММР-2, ММР-7, і МТ1-ММР після stimu тва макрофагів з LPS (100 нг / мл) для вираження 24 годин. Gene була виміряна за допомогою кількісної ОТ-ПЦР із загальної РНК зразків (А) і нормовані на HPRT1 і GNB2L1 експресії. Зазначені значення представляють собою складки зміни в порівнянні з необробленим контролем (значить ± SD, п = 5, * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001). ФНП та ІЛ-6 індукції під стимуляції ЛПС були додатково підтверджені ELISA (B) (середнє значення ± SD, * р <0,05).
