67 гостей
ДЕЯКІ молекулярно-БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ метастатичний колоректальний РАКУ
1 Кіт О.І. 1 Геворкян Ю.А. 1 Солдаткина Н.В. 1 Новикова И.А. 1 Водолазький Д.І. 1 Шуліков П.Б. 1 Харагезов Д.А. 1 Ільченко С.А. 1 Дашков А.В. 1 Полуектов С.І. 1
1 ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» Міністерства охорони здоров'я Росії »
Спрямованість сучасної онкології до персоналізованої терапії ініціює проведення молекулярно-біологічних досліджень пухлин, в тому числі і колоректальних, з метою кращого розуміння їх біологічної сутності і визначення нових мішеней для спрямованої терапії. Мета дослідження: вивчити деякі біологічні особливості метастатичного колоректального раку. Методи. Об'єктом дослідження послужили дані про 48 хворому на колоректальний рак T1-4N0-2M0-1. Проведено аналіз клінічних, морфологічних і молекулярних особливостей локалізованих і метастатичних форм пухлин товстої і прямої кишки. Дослідження циркулюючих пухлинних клітин проводили з використанням системи CellSearchTMVeridex. У зразках тканин пухлин проводили визначення 7 SNP-мутацій в 12 і 13 кодонах гена KRAS з використанням термоциклері Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США). Результати дослідження показали, що первинно-метастатичні форми колоректального раку спостерігаються переважно у жінок і розташовуються в ободової кишці. Метастатичні колоректальні пухлини відрізняються зміщенням диференціювання в сторону нізкодіфференцірованних аденокарцином і збільшенням частоти виявлення та середнього числа (в 3,7 рази) циркулюючих пухлинних клітин. Більш високий метастатичний потенціал мають метастатичні пухлини з диким типом гена KRAS. Висновок. Метастатичні колоректальні пухлини мають молекулярно-біологічні особливості щодо ступеня диференціювання пухлини, характеристики гена KRAS, вмісту циркулюючих пухлинних клітин в периферійній крові. Виявлені особливості можливо враховувати для прогнозування клінічного перебігу захворювання та планування лікування.
метастатический колоректальний рак
молекулярно-біологічні особливості
1. Бєляєва О.В. Мутації в гені K-ras у хворих на колоректальний рак: епідеміологія та клінічне значення: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 2012. - 24 с.
2. Владимирова Л.Ю., Геворкян Ю.А., Абрамова Н.А., Солдаткина Н.В. Оцінка ефективності та токсичності моноклонального антитіла до EGER панітумумабу при колоректальному раку // Матеріали VII з'їзду онкологів і радіологів країн СНД. Астана. - 2012. - С. 189.
3. Імянітов Е.Н., Моїсеєнко В.М. Застосування молекулярно-генетичного аналізу для вибору протипухлинної цитостатичної терапії // Онкогематологія. - 2007. - № 3. - С. 4-8.
4. Кіт О.І., Геворкян Ю.А., Солдаткина Н.В., Колесніков В.Є., Харагезов Д.А. Лапароскопічні комбіновані оперативні втручання при метастатичному колоректальному раку // Колопроктології. - 2015. - № 4 (54). - С. 19-23.
5. Кіт О.І., Новікова І.А., Бахтін А.В., Нікіпєлова Е.А., Шатова Ю.С., Габараева В.М., Ністратова О.В. Перший досвід детекції циркулюючих пухлинних клітин в периферійній крові // Міжнародний журнал експериментального освіти. - 2013. - № 11-2. - С. 37-39.
6. Кушлінскій Н.Є., Ісаков В.А., Делекторська В.В. Колоректальний рак. Пухлинні маркери і молекулярно-генетичні методи діагностики // Сибірський онкологічний журнал. - 2004. - № 2-3. - С. 134-148.
7. Bzhadug OB, Tjuliandin SA, Grivtsova L.Yu. The prognostic value of circulating tumor cells in blood of patients with advanced breast cancer // Haematopoiesis Immunology. - 2007. - № 4. - Р. 73-101.
8. Tol J., Koopman M., Cats A. et al. Chemotherapy, bevacizumab, and cetuximab in metastatic colorectal cancer // N. Engl. J. Med. - 2009. - № 360. - Р. 563-572.
Проблема метастатичного колоректального раку в останнє десятиліття стала особливо актуальною, що обумовлено не тільки збільшенням числа метастатичних форм пухлин товстої і прямої кишки, але, в основному, впровадженням високотехнологічних методів лікування, які дозволили значно поліпшити результати лікування і досягти 5-річної виживаності. В ряду інноваційних методів лікування особливо слід відзначити: сучасні схеми поліхіміотерапії (FolFox, Xelox, FolFiri), застосування таргетних препаратів, хірургічне лікування метастатичних форм колоректального раку (в тому числі і малоінвазивне), радіочастотну термоабляції метастазів в печінці [2; 4; 8].
Успіхи в області лікарської терапії метастатичного колоректального раку стали можливі завдяки фундаментальним дослідженням, які привели до прогресу в розумінні молекулярних механізмів колоректального раку і визначили молекулярні мішені для спрямованої протипухлинної терапії [1]. Так, в арсеналі онкологів з'явилися такі препарати, як цетуксимаб і панітумумаб - моноклональні антитіла до рецептора EGER, і бевацизумаб - моноклональні антитіла до рецепторів судинного ендотеліального фактора росту. Проведені численні дослідження показують ефективність таргетних препаратів як в монорежиме, так і при включенні їх в режими хіміотерапії метастатичного колоректального раку [2; 8].
Важливим досягненням в лікарської терапії злоякісних пухлин є можливість визначення молекулярно-генетичних маркерів хіміочувствітельності, розвитку побічних токсичних ефектів і ризику прогресування пухлини. Так, в даний час встановлено, що на ризик прогресування впливають: анеуплодія, відсоток клітин в S-фазі циклу, Микросателлитная нестабільність, рівень тимідилатсинтетази, рівень білків Pgp 170, MRP, LRP, мутації p27, p53, гіперекспресія Bcl-2, зменшення експресії CD95, експресія епідермальних і ендотеліальних факторів росту [6].
Молекулярними маркерами відповіді на хіміотерапію є: p53, EGFR, Ki-67, p21, bcl-2 і тіміділатсінтетазу [6]. Визначено і фактори, що визначають відсутність чутливості до хіміотерапії, наприклад для оксаліплатину і іринотекану - це тести «cross-complementinggene ERCC1» і «topo-isomerase-1 (Topo1)» [3].
Останнім часом активно вивчаються і циркулюючі пухлинні клітини при злоякісних пухлинах, в тому числі і при колоректальному раку. Так, встановлено, що при метастатичних формах раку циркулюючі пухлинні клітини виявляються у 70% хворих, при локалізованих - у 30-40%. Виявлення циркулюючих пухлинних клітин у хворих після завершення ад'ювантної хіміотерапії свідчить про розвиток прогресування захворювання в 70% випадків [5; 7]. В даний час встановлюється зв'язок кількості циркулюючих пухлинних клітин зі стадією, клінічним перебігом, особливостями прогресування раку.
Успішне впровадження досягнень фундаментальної онкології в клінічну практику ініціює проведення нових фундаментальних досліджень, які дозволять краще зрозуміти біологічну сутність колоректальной пухлини і визначать нові мішені для спрямованої терапії.
Мета роботи - вивчити деякі біологічні особливості метастатичного колоректального раку.
Матеріал і методи. У дослідження включено 48 хворих на колоректальний рак T1-4N0-2M0-1, які перебували на лікуванні в клініці ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ РФ в 2015-2016 рр. Серед хворих було 48 (52,7%) жінок і 43 (47,3%) чоловіки. Середній вік пацієнтів на момент лікування склав 62,3 року. Пухлина локализовалась в прямій кишці у 32 (35,2%) хворих, в сигмовидної кишці - у 25 (27,5%) хворих, ободової кишці - у 34 (37,4%) хворих. У всіх хворих гістологічно пухлини характеризувалися як аденокарциноми різного ступеня диференціювання: G1 - в 4 (4,4%) випадках, G2 - в 70 (76,9%) випадках, G3 - в 17 (18,7%) випадках. За класифікацією TNM виявлено наступний розподіл: Т2 - 2 (2,2%) хворих, Т3 - 21 (23,1%), Т4 - 68 (74,7%). Метастази в регіонарних лімфовузлах виявлені у 49 (53,8%) хворих. Первинно генералізовані форми з метастазами в печінку (T1-4N0-2M1) були у 26 (49) хворих, вони склали основну групу пацієнтів. У 42 хворих колоректальні пухлини були локалізовані, без віддалених метастазів (T1-4N0-2M0), ці пацієнти склали контрольну групу. Всім хворим виконані ціторедуктівних і радикальні оперативні втручання. У хворих обох груп досліджували вміст циркулюючих пухлинних клітин і наявність мутацій гена KRAS.
Для цього до оперативного втручання у хворих виробляли паркан 7,5 мл крові в пробірки CellSavePreservativeTube, що містять антикоагулянт ЕДТА, а також реагент для збереження життєздатності пухлинних клітин. Детекцию циркулюючих пухлинних клітин проводили з використанням системи CellSearchTMVeridex (Johnson & Johnson, США). Для відділення клітин крові і пухлинних від плазми кров змішувалася з робочим буфером з набору реагентів CellSearch® CTCkit і центрифугували при прискоренні 800 g протягом 10 хвилин. Після цього зразки переносилися в апарат CellTracks® AutoPrep® System, який в автоматичному режимі, видаляючи плазму крові і формені елементи, іммуномагнітно збагачував зразок мікрочастинками заліза, покритими антитілами до маркерів адгезії епітеліальних клітин ЕрСАМ, СD45 і цитокератин 8,18,19. Якість роботи системи оцінювали з використанням стандартного контролю СТС controlkit. Матеріал сканувався в аналізаторі CellTracks® AnalyzerII®. З урахуванням морфологічних характеристик і експресії маркерів реєструвалися циркулюючі пухлинні клітини. Загальна кількість виявлених пухлинних клітин було кінцевим результатом.
З фіксованих в 10% -ному забуференном формаліні і залитих в парафін зразків тканин пухлин, отриманих після оперативного втручання, отримували зрізи товщиною 8-10 мкм. Процедура екстракції ДНК включала в себе стандартну депарафінізації зрізів. Потім зразки обробляли набором реагентів QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGENE, Німеччина) згідно з протоколом виробника. Концентрацію виділеної із зразків ДНК вимірювали на флюоріметре Qubit 2.0® з використанням набору Quant-iT ™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Концентрація ДНК нормалізувалася до величини 1 нг / мкл. За допомогою набору реагентів Real-Time-PCR-KRAS-7M ( «Біолінк», Росія) проводили визначення 7 SNP-мутацій (Single Nucleotide Polymorphism) в 12 і 13 кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A , G13D з використанням термоциклері Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США). Статистичний аналіз виконували з використанням пакетів програм Microsoft Excel 2010 і STATISTICA 8.0. Оцінку відмінностей проводили з використанням χ2-критерію і точного двостороннього критерію Фішера, при порівнянні кількості ЦОК застосовували критерій Манна -Уітні для рівня статистичної значущості р <0,05.
Результати дослідження
У групі пацієнтів з метастатичним колоректальний рак середній вік хворих склав 59,49 року. Серед хворих було 32 (65,3%) жінки (середній вік 59,35 року) і 17 (34,7%) чоловіків (середній вік 59,77 року). Пухлина локализовалась в прямій кишці у 15 (30,6%) хворих, в сигмовидної кишці - у 13 (26,5%) хворих, ободової кишці - у 21 (42,9%) хворих. У всіх хворих гістологічно пухлини характеризувалися як аденокарциноми різного ступеня диференціювання: G1 - в 2 (4,1%) випадку, G2 - в 40 (81,6%) випадку, G3 - в 7 (14,3%) випадках. За класифікацією TNM виявлено наступний розподіл: Т3 - 4 (8,2%), Т4 - 46 (92,3%). Метастази в регіонарних лімфовузлах виявлені у 38 (77,6%) хворих.
Мутації гена KRAS виявлені у 13 (26,5%) хворих, що циркулюють пухлинні клітини виявлені у 38 (77,6%) хворих на метастатичний колоректальний рак. Якщо розглядати особливості метастатической колоректальной пухлини в залежності від стану гена KRAS і особливостей вмісту циркулюючих пухлинних клітин, то отримаємо такі дані. При однаковому характері розподілу гістологічної структури пухлини і частоті наявності циркулюючих пухлинних клітин (табл. 1) у пацієнтів з метастатичним колоректальний рак з диким типом гена KRAS середнє число циркулюючих клітин в 5 разів вище, ніж при мутувати гені KRAS (р = 0,0010) .
Таблиця 1
Особливості метастатических колоректальних пухлин
в залежності від стану гена KRAS
Стан гена KRAS
Є мутація 13 (26,5%)
Ні мутації 36 (73,5%)
наявність ЦОК
10 (76,9%)
28 (77,8%)
1,0
Середнє число ЦОК
2,8 (1-9)
14,5 (1-121)
0,0010
аденокарцинома G1
аденокарцинома G2
аденокарцинома G3
0
12 (92,3%)
1 (7,7%)
2 (5,6%)
28 (77,8%)
6 (16,7%)
0,24
Примітка: p - статистична значимість відмінностей між групами.
У пацієнтів з метастатичним колоректальний рак з наявністю циркулюючих пухлинних клітин спостерігається така ж частота мутацій гена KRAS, як і у пацієнтів без виявлених циркулюючих пухлинних клітин (табл. 2). А ось в гістологічної структурі пухлин ми знайшли достовірні зміни. Так, циркулюючі пухлини клітини достовірно частіше (p = 0,040) виявляються при зміщенні диференціювання аденокарциноми в сторону низькодиференційованих пухлин.
Таблиця 2
Особливості метастатических колоректальних пухлин в залежності від наявності циркулюючих пухлинних клітин
Наявність ЦОК 38 (76,9%)
Відсутність ЦОК 11 (23,1%)
Середнє число ЦОК
11,5 (1-121)
-
Мутації гена KRAS
10 (25,3%)
3 (27,3%)
1,0
аденокарцинома G1
аденокарцинома G2
аденокарцинома G3
0
32 (84,2%)
6 (15,8%)
2 (18,2%)
8 (72,7%)
1 (9,1%)
0,040
Примітка: p - статистична значимість відмінностей між групами.
У групі пацієнтів з локалізованим на колоректальний рак без віддалених метастазів середній вік хворих склав 62,9 року. Серед хворих було 15 (35,7%) жінок (середній вік 64,22 року) і 27 (64,3%) чоловіків (середній вік 61,71 року). Пухлина локализовалась в прямій кишці у 17 (40,5%) хворих, в сигмовидної кишці - у 13 (31,0%) хворих, ободової кишці - у 12 (28,6%) хворих. У всіх хворих гістологічно пухлини характеризувалися як аденокарциноми різного ступеня диференціювання: G1 - в 2 (4,8%) випадках, G2 - в 29 (69,0%) випадках, G3 - в 11 (26,2%) випадках. За класифікацією TNM виявлено наступний розподіл: Т2 - 2 (4,8%) хворий, Т3 - 17 (40,5%), Т4 - 23 (54,8%). Метастази в регіонарних лімфовузлах виявлені у 11 (26,2%) хворих.
Серед хворих на колоректальний рак без віддалених метастазів мутації гена KRAS спостерігалися у 16 (38,1%) пацієнтів. Наявність мутації не впливає на частоту виявлення і середнє число циркулюючих пухлинних клітин при локалізованої колоректальной пухлини (табл. 3), але впливає на диференціювання аденокарциноми. Це проявляється в зміщенні диференціювання аденокарциноми в сторону низькодиференційованих пухлин при наявності мутації гена KRAS в пухлинних клітинах.
Таблиця 3
Особливості колоректальних пухлин без віддалених метастазів в залежності від стану гена KRAS
Стан гена KRAS
Є мутація 16 (38,1%)
Ні мутації 26 (61,9%)
наявність ЦОК
121 (68,8%)
17 (65,4%)
0,73
Середнє число ЦОК
3 (1-10)
3,1 (1-14)
0,78
аденокарцинома G1
аденокарцинома G2
аденокарцинома G3
2 (12,5%)
5 (31,3%)
9 (56,3%)
0
24 (92,3%) *
2 (7,7%) *
0,00009
Примітка: p - статистична значимість відмінностей між групами.
Чутки, які пухлинні клітини виявлені у 29 (69,0%) хворих на колоректальний рак без віддалених метастазів. Результати дослідження показали, що при локалізованому колоректальний рак з наявністю циркулюючих пухлинних клітин достовірно частіше зустрічається мутація гена KRAS в порівнянні з локалізованими пухлинами без циркулюючих пухлинних клітин (табл. 4). За іншими показниками в цих підгрупах хворих достовірних відмінностей не було.
Таблиця 4
Особливості колоректальних пухлин без віддалених метастазів в залежності від наявності циркулюючих пухлинних клітин
Наявність ЦОК 29 (69,0%)
Відсутність ЦОК 13 (31,0%)
Середнє число ЦОК
3,1 (1-14)
-
0,49
Мутації гена KRAS
14 (48,3%)
2 (15,4%)
0,043
аденокарцинома G1
аденокарцинома G2
аденокарцинома G3
2 (6,9%)
20 (69,0%)
7 (24,1%)
0
9 (69,2%)
4 (30,8%)
0,44
Примітка: p - статистична значимість відмінностей між групами.
Обговорення. Основну частину пацієнтів з первинно метастатичний колоректальний рак, на відміну від пацієнтів з локалізованою колоректальной пухлиною, склали жінки (2/3 пацієнтів), причому за віком вони були на 5 років молодше, ніж при локалізованої пухлини. При первинно метастатическом колоректальний рак в 1,5 рази частіше, ніж при локалізованому, пухлина розташовувалася в ободової кишці. Метастатичні колоректальні пухлини були, в основному, і місцево розповсюджений: виходили за межі кишкової стінки (92,3%) і мали метастази в регіонарних лімфовузлах (76,9%). Колоректальні пухлини без віддалених метастазів мали і менший ступінь поширення: пухлина локалізувалася тільки в межах кишкової стінки у 45,4% хворих, виходила за межі кишкової стінки у 54,6% хворих. Локалізовані колоректальні пухлини в більшості випадків (72,7%) були без віддалених метастазів. Відносно ступеня диференціювання пухлини ми не знайшли відмінностей між групами метастатичного і локалізованого колоректального раку: в обох групах переважали G2 аденокарциноми (69,0-81,6%), випадки G1 аденокарциноми були поодинокі.
Мутації гена KRAS виявлені у третини хворих на колоректальний рак (у 26,5% випадків метастатичної пухлини і в 38,1% випадків локалізованої пухлини).
У пацієнтів з метастатичним колоректальний рак з диким типом гена KRAS середнє число циркулюючих клітин в 5 разів вище, ніж при мутувати гені KRAS (р <0,05). При дикому типі гена KRAS частота виявлення циркулюючих клітин в крові хворих вище при метастатичних пухлинах (77,7%), ніж при локалізованих (65,4%).
При локалізованої колоректальной пухлини з диким типом гена KRAS вищє частота G2 аденокарциноми (92,3%) в порівнянні з метастатічнім раком (77,8%), при якому спостерігається зміщення діференціювання аденокарциноми в сторону нізькодіференційованіх пухлина. При зміщенні диференціювання аденокарциноми в сторону низькодиференційованих пухлин при метастатичному раку спостерігається достовірне збільшення частоти виявлення циркулюючих пухлинних клітин.
Колоректальні пухлини з мутованим геном KRAS відрізняються по диференціювання аденокарцином в залежності від поширеності пухлини. Так, при локалізованої формі пухлини в половині випадків спостерігалися низькодиференційовані аденокарциноми, при цьому зустрічалися і помірно і високодиференційовані аденокарциноми. При первинно метастатических пухлинах гістологічно пухлини були представлені, в основному, помірно аденокарцинома.
Чутки, які пухлинні клітини виявлені нами у 3/4 хворих на колоректальний рак. При цьому середнє їх число в 3,7 рази було вище при пухлинах з віддаленими метастазами. Отримані нами дані узгоджуються з результатами інших досліджень, що виявили циркулюючі пухлинні клітини у 70% хворих метастатичними формами раку. Крім того, в даний час встановлено зв'язок між виявленням циркулюючих пухлинних клітин і перебігом захворювання, розвитком прогресування пухлини [5; 9]. Ці дані підтверджують високий ризик розвитку метастазів пухлини при наявності циркулюючих пухлинних клітин в периферійній крові. Доцільно використання циркулюючих пухлинних клітин як фактора прогнозу клінічного перебігу пухлини і ефективності терапії, що вже відображено в рекомендаціях ASCO і FDA.
У підгрупі хворих локалізованим на колоректальний рак з наявністю циркулюючих пухлинних клітин в 2 рази частіше зустрічалася мутація гена KRAS в порівнянні з локалізованими пухлинами без циркулюючих пухлинних клітин і з метастатичними раками. Ці дані потребують подальшого дослідження.
Таким чином, метастатичні колоректальні пухлини мають молекулярно-біологічні особливості, які можливо враховувати для прогнозування клінічного перебігу захворювання та при плануванні лікування.
Висновки
- Первинно-метастатичні форми колоректального раку переважно спостерігаються у жінок на 5 років молодше, ніж при локалізованої пухлини. Первинна пухлина в 1,5 рази частіше розташовується в ободової кишці і має і місцево розповсюджений характер (виходить за межі кишкової стінки (92,3%), і метастази в регіонарних лімфовузлах (76,9%)).
- При метастатичному колоректальному раку спостерігається зміщення диференціювання аденокарциноми в сторону низькодиференційованих пухлин, що супроводжується достовірним збільшенням частоти виявлення та середнього числа (в 3,7 рази) циркулюючих пухлинних клітин.
- Метастатичний колоректальний рак з диким типом гена KRAS має більш високий метастатичний потенціал: в 1,2 рази вище частота виявлення і в 5 разів вище середнє число циркулюючих пухлинних клітин (р <0,05).
бібліографічна ПОСИЛАННЯ
Кіт О.І., Геворкян Ю.А., Солдаткина Н.В., Новікова І.А., Водолазький Д.І., Шуліков П.Б., Харагезов Д.А., Ільченко С.А., Дашков А .В., Полуектов С.І. ДЕЯКІ молекулярно-БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ метастатичний колоректальний РАКУ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 3.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26362 (дата звернення: 01.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?
