Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Початковий фенотипування експерименти необхідні для характеризують нові види і штами і може використовуватися в якості безкоштовного підхід до філогенетика і експериментів гібридизації ДНК-ДНК, які використовуються для опису нових видів. Стрептоміцети мутантів, що випливають з випадкових мутагенезу методів, таких як хімічна, УФ, або transposon мутагенезу зазвичай визначаються по прямій, візуальний екранів на плитах агару. Колонії Streptomyces розглядаються зміни в фенотипі в порівнянні з здичавів тип, батьківський сорт. Наприклад Запальнички кольорові повітряного міцелію може вказувати на більш низький рівень сірого пігменту, викликані дефектом заспореніе або відсутність нечітких поява свідчить про блоку у формуванні повітряного міцелію (рис. 1). Багато стрептоміцетов виробляють пигментированной антибіотиків в вегетативного міцелію або навколишні агар. S. coelicolor виробляє два пигментированной антибіотиків, а також два з них-пігментовані. Actinorhodin синьо пігментовані антибіотиками і undecylprodigiosin червоно пігментовані антібіотік45. Штами, які зазнали екрани початкового візуального колонії потім передаються мелірування для одного колоній.

Після візуальної ідентифікації потенційно цікавих мутантів штами піддаються мікроскопічного дослідження. Фазово контрастної мікроскопії особливо підходить для вивчення Streptomyces мутантів для дефектів розвитку, використовуючи здичавів тип деформації як елемент управління (рис. 2). Дикого типу S. coelicolor колонії, як правило, виробляють повітряного міцелію приблизно двох днів зростання на 30 ° C на MS агар, і довгі ланцюги суперечки на три дня зростання. Життєвий цикл буде розвиватися трохи повільніше або швидше, на інші види засобів масової інформації. Важливо, що мутанти аналізуватися на тих же умовах зростання як дикого типу при підготовці висновків про вад і затримки. Лисі мутанти можуть виробляти суперечки після тривалого зростання на агарі ЗМІ. Клас мутантів, іменований як білий мутантів або може бути відкладено для формування споро, показують зниження велика кількість суперечки виробництва, виробляють суперечки з дефекти форми і / або розмір, або просто виробляти більш низького рівня зрілої, сірий споро пігмент46. Інші мутанти, розслідування до теперішнього часу може бути відкладено або прискорився в прогресії життєвого циклу таких мутантів, які постраждали за накопичення сигнальних молекул (наприклад, циклічні ді GMP47).

Мікроскопії флуоресцірованія, використовуючи пропідій йодидом пляма хромосомної ДНК нуклеоїд і дневно позначені зародків пшениці агглютінінов пляма клітинної стінки заспореніе септи просте продовження світлової мікроскопії метод, описаний вище. Спори, не вистачає хромосоми буде позбавлена червоний пропідій йодидом, фарбування, хоча суперечки, які містять менше ДНК, ніж зазвичай може визначити, якщо вони, як видається, зменшилися фарбування (рис. 3). Зародки пшениці агглютінінов можуть бути використані для пляма клітинної стінки і можуть спостерігатися відмінності в клітинної стінки, фарбування моделей (наприклад, поділ клітин дефектів). У малюнку 4 здичавів типу штаму S. venezuelae, види, які недавно використовується як інший моделі стрептоміцетовой через його швидше життєвий цикл і можливість sporulate в жідком45, був забарвлених з WGA-FITC для з'ясування сходи як масив поділ перегородками, які зазвичай розглядаються в ранній період заспореніе.

Початковий фенотипування стратегій, описаних тут має привести в наступному: 1) ідентифікація мутантних штамів інтерес для подальшого вивчення; 2) набуті знання про недавно виявлених мутант і потенційної ролі ген, який мутував; 3) формулювання наступної серії наступний експериментальний кроків, які можуть використовуватися для подальшого уточнення ролі в питанні гена. У разі нововиявлених стрептоміцетовой з навколишнього середовища дослідник буде отримати знання про потенційних нових видів, в порівнянні з вже охарактеризовані види Streptomyces.

Малюнок 1: Фотографія представник агар пластини, демонструючи макроскопічних колонії фенотип S. coelicolor. Плита агару показує нечіткий, сірий зовнішній вигляд повітряного міцелію для дикого типу S. coelicolor штаму MT1110 (WT) в порівнянні з різних випадкових transposon вставки мутантів з розвитку фенотипів. Мутанти відсутні або повітряного міцелію [лисий (bld)] або повітряного міцелію зі скороченням споро пігментації [білий (whi)]. Transposon мутанти були отримані за допомогою міні Tn5 для вставки мутагенеза6,7. Штами були вирощені на MS агар для 5 днів при температурі 30 ° C. Петрі блюдо діаметр, 100 мм.

Малюнок 2: Фазово контрастної мікроскопії показані представник повітряних розжарювання для S. coelicolor білий мутантних штамів містять випадкові transposon вставки мутації. Показано на малюнку (A) є представником дикого типу повітряних розжарювання, яка зазнала синхронної, регулярно розташованих клітинних поділів, проводити рівномірно формою і розміром суперечки (MT1110). (F B -) Решта панелі показують значно відрізняються мікроскопічних фенотипів різних білий мутантів, які були ізольовані через випадкові transposon мутагенезу. Група B показує повітряні розжарювання, не зазнала заспореніе, але замість випустила опуклі областей всередині нитки напруження. Довгі стрілки в C, D і F показують аномально великі суперечки, які характерні для мутантів, MIC42, MIC43 і TH49. Короткі стрілку на панелі D вказує приклад лу споро відсіку. Група E показує частково згорнуті невеликих відсіках, які є типовими для ланцюгів швидко, вироблені мутант TH10. Штами були вирощені на MS агар для 5 днів при температурі 30 ° C. Мутанти не пов'язані з тим, як показано на малюнку 1. Спори дикого типу знаходиться приблизно в 1,1 мкм на довгій осі. Шкали бар = 2 мкм. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: Представник мікроскопії показані мутант хромосома S. coelicolor сегрегація фенотипів. (A) A діаграмі уявлення показує типовий здичавів тип, регулярно розташованих фарбування вид для ланцюга суперечки (кожен суперечка містить хромосомної ДНК) в порівнянні з переривчастою фарбування шаблон для мутант, який відображає хромосоми дефект сегрегації. (B) кожна пара панелей показує же споро ланцюга спостерігається контраст диференціальної перешкоди (DIC) зображення зліва і пропідій йодид забарвлених флуоресценції зображення показано праворуч. Фенотип здичавів типу (а, б) порівнюється з двома мутантів вставки випадкових transposon (c, d і e, f). Стрілки показують суперечки позбавлений ДНК. Штами були вирощені на MS агар для 5 днів при температурі 30 ° C. Мутанти показано пов'язані з тим, на малюнку 1 і на малюнку 2. Шкали бар = 1 мкм. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: Мікрофотографія флуоресценції штаму S. venezuelae здичавів типу забарвлених з WGA-FITC. (A) A схема повітряних розжарювання з'являється гладка з без відступів і є ніяких видимих ознак за допомогою фазово контрастної мікроскопії в порівнянні зі сходів як масив плямувати клітинних стінок, вказує на ранній стадії заспореніе заспореніе в цій же нитки, використовуючи WGA-FITC під мікроскопії флуоресцірованія розпочато. (B) мікроскопії здичавів типу S. venezuelae. () Гладкою повітряні нитки присутні серед ланцюга суперечки. (B) в межах міцелій, які відображаються в панелі, одна повітряна розжарювання на ранній стадії в розвитку має сходи як масив осадження клітинної стінки. Стрілки показують, регулярно інтервалу формування крос стіни заплямована WGA-FITC, що розвиватися синхронно в межах тільки однієї нитки напруження повітряні, як вона піддається розвиваючих пов'язані заспореніе. Штам був вирощений на MYM MYM (Maltose, YВосток, екстракт alt M) агар для 38 h при 30 ° C. Шкали бар = 2 мкм. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.