Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Ізоляція бактерій містять phagosomes цей протокол вимагає biotinylation бактерій в якості першого кроку. Тому ми провели оцінку ефективності S. typhimurium biotinylation конфокальна мікроскопія аналіз BMDMs, інфікованих біотінілірованние mCherry - S. typhimurium позначені Cy5-стрептавідину. Коротенько BMDMs були інфіковані, як описано в цьому протоколі з mCherry - S. typhimurium раніше біотінілірованние але не інкубували з кон'югованих стрептавідину магнітні намиста. Після інкубації в 30 хвилин при 37 ° C клітини були промивають теплою PBS та фіксованого з 4% формальдегіду, за 20 хв на RT. фіксації був зупинений великі Пральна з PBS. Клітини були потім permeabilized з 3% Тритон в PBS на 5 хв на RT. інфікованих BMDMs потім інкубували з Cy5-стрептавідину 20 хв при 4 ° C. Після великих прання, зразки були підготовлені для аналізу confocal мікроскопії (рис. 1). Чи не біотінілірованние mCherry - S. Typhimurium використовувався в якості негативного контролю. Флуоресцентного сигналу від Cy5-стрептавідину було відзначено виключно в біотінілірованние mCherry - S. typhimurium, що підтверджує що biotinylation бактерій був успішним. Мікроскопічні аналіз був проведений на конфокального мікроскопа за допомогою «60 X O2 NA: 1.40» мета. Хвилі збудження для флуорохромов були 405 нм (DAPI), 559 Нм (mCherry) і 635 нм (Cy5) і ПМТ напруги був встановлений в 574v, 565v і 443v, відповідно.

Починаючи з імунної реакції викликані S в макрофагах. typhimurium в значній мірі залежить від поверхні рецептор активації макрофагів, бактеріальних лігандів, далі ми тестували, якщо покриття S. typhimurium з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні кульки можуть змінити вроджений імунну відповідь в заражених BMDMs. Ми спочатку оцінити чи покриття S. typhimurium може змінити фагоцитарної здатності BMDMs, confocal мікроскопії. BMDMs були інфіковані, як описано в цьому протоколі з mCherry - S. Typhimurium з покриттям з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста або крейдованого mCherry - S. typhimurium. Після інкубації в 30 хвилин при 37 ° C клітини були промивають теплою PBS і фіксується з 4% формальдегіду для 20 хв на RT. Після великих прання з PBS, зразки були підготовлені для аналізу confocal мікроскопії. Як показано на малюнку 2, макрофаги фагоцитованих крейдованому і крейдованого паперу mCherry - S. typhimurium однаково.

Далі ми проаналізували запальної реакції, викликані S. typhimurium з покриттям з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста (рис. 3). Supernatants від інфікованих крейдованому і крейдованого паперу S. BMDMs typhimurium були зібрані після 24 h інфекції для ензим з'єднаний assay імуносорбенту (ELISA) виділяється інтерлейкіну-6 (IL-6). Покриття S. typhimurium з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста не вплинуть запальної реакції макрофагів.

Щоб оцінити чистоту бактерії містять phagosomes, отримані шляхом застосування цього Протоколу ми проаналізували ізольованих mCherry - S. typhimurium -містять phagosomes immunoblotting. Використання специфічних антитіл проти тег mCherry, ми виявили значне збагачення mCherry висловлюючи S. typhimurium в ізольованих phagosomes в порівнянні з цитозольних фракції, отримані з того ж зразка (рис. 4). Ізольовані phagosomes, що містять mCherry - S. typhimurium, який не був раніше покриті біотину були використані в якості негативного контролю. Ці результати показують, що цей протокол дозволяє для очищення phagosomes, які є високо збагачений бактерій.

Далі ми провели аналіз immunoblot endosome і лізосомальних маркерів в ізольованих phagosomes, що містять S. typhimurium (Рис. 5). Більшість маркерів endosome і лізосомальних були чітко простежується в phagosomes, ізольовані на 4 ч після інфекції в порівнянні з 30 хв. Збагачення від англ маркери Rab5 і Rab7, а також Лізосома маркери v АТФази (0 V і V1 підрозділу) і катепсина Д, були помічені. Цікаво, що було відзначено тільки розсіченого форма катепсини D в ізольованих phagosomes на 4 ч після інфекції. Розщеплення про катепсина Д (48 кДа) виробляти короткі активної форми (33 кДа) відбувається тільки в phagosomes, але не в цитоплазмі, демонструючи специфіку цього Протоколу для ізоляції фагосоми.

Так як маркери від органели мітохондрії або ендоплазменний ретикулум (ER) часто виявляються в препарати бактерій містять ізольовані phagosomes, S. typhimurium -містять ізольовані phagosomes були зондіруемой з специфічними антитілами проти мітохондріальної транспортер Tomm20 і ER білок calnexin (рис. 6). Ми також протестували їх з антитіло проти гліколіз ферменту GAPDH оцінити цитозольних забруднення в ізольованому phagosomes. Ми знайшли мітохондрії і ER маркерів в S. typhimurium -ізолірованние phagosomes але не цитозольних забруднення.

Для вивчення універсальність протоколу для ізоляції бактерій містять phagosomes, біотин і кон'югованих стрептавідину магнітної намистини покриття процедури був застосований до грампозитивні бактерії S. aureus. Використовуючи ж фіксації і забарвлення протокол, як описано для mCherry - S. typhimurium (Рис. 1), ми підтвердили успішні biotinylation зеленого флуоресцентного білка (ГФП) висловлюючи - S. aureus (рис. 7). Крім того, ми виявили збагачення endosome маркер Rab7 і лізосомальних маркери v АТФази (V0 субодиниці) і катепсина D аналіз immunoblot ізольованих GFP - S. aureus -містять phagosomes (рис. 8). Виявлено після 4 h інфекції в зразках ізольованих фагосоми, але не в цитозольних фракції був тільки розщеплення катепсини D в зрілі форми. Ізольовані S. aureus -містять phagosomes були вільні від цитозольних забруднення, як показано на immunodetection GAPDH.

В цілому ми продемонстрували, що наш Протокол ізоляції фагосоми дозволяє ізоляції високозбагаченого бактерій містять phagosomes, безкоштовно цитозольних забруднення. Ізольовані фагосоми препаратів може використовуватися для аналізу endosome і лізосомальних маркерів для вивчення phagosome дозрівання. Крім того було показано, що цей протокол може використовуватися для грамнегативних і грампозитивних бактерій і що маркування процедура не змінює імунна реакція макрофагів.

Малюнок 1: Флуоресцентної мікроскопії аналіз біотінілірованние S. typhimurium за допомогою Cy5-стрептавідину. BMDMs були інфіковані за 30 хвилин з mCherry - S. typhimurium що біотінілірованние ( «біотінілірованние S. Т.»), як описано в цьому Протоколі. Чи не біотінілірованние mCherry - S. typhimurium ( «Не біотінілірованние S. Т.») використовувався в якості негативного контролю. Після фіксації і permeabilization клітин зразки інкубували з Cy5-стрептавідину 20 хв при 4 ° C. флуоресценції сигнал від ядра (DAPI), mCherry - S. typhimurium і Cy5-стрептавідину були проаналізовані за допомогою конфокальної мікроскопії. Сигнал від Cy5-стрептавідину можуть бути виявлені тільки в бактерії, раніше помічені біотин, підтвердивши тим самим ефективним biotinylation. Шкали бар = 10 мкм. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: Мікроскопічні аналіз BMDMs, інфікованих mCherry - S. typhimurium покриттям з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста. BMDMs були заражені mCherry - S.typhimurium позначені біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста, як описано в цьому Протоколі. Після дозволяючи макрофаги фагоцитують бактерій на 30 хв, клітини були виправлені з 4% формальдегіду для 20 хв на RT. Покриті бактерії фагоцитованих макрофагами, потім були проаналізовані confocal мікроскопії. Аналіз показав, що споживання покриттям бактерій ( «покриттям Ф. Т.») можна порівняти з споживання немічених mCherry бактерій ( «не покриті S. Т.»), демонструючи, що маркування з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста не змінюють фагоцитоз S. typhimurium макрофагами. Ядра були забарвлених DAPI для мікроскопії візуалізації. Дані відображаються як середній ± SEM, і статистичної значущості розраховується студент t-тест представлена як * = p <0,05; ** = p <0,01; = P <0,001. Шкали бар = 40 μm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: Секрецію ІЛ-6, BMDMs, інфікованих кон'югованих біотину і стрептавідину магнітні намиста, позначені S. typhimurium в порівнянні з непідписаних Ф. typhimurium. BMDMs були заражені S. typhimurium з біотину і кон'югованих стрептавідину магнітні намиста покриттям, як описано в цьому Протоколі. Після 24 h інфекції supernatants були зібрані для подальшого аналізу секреції ІЛ-6 ELISA. Supernatants формують BMDMs, інфікованих крейдованого S. typhimurium були використані в якості елемента керування. Індукція секреції ІЛ-6, покриті S. typhimurium ні істотно відрізняється в порівнянні з крейдованого S. typhimurium. Дані відображаються як середній ± SEM, і статистичної значущості, розрахованих з використанням студент t тест представлений як * = p <0,05; ** = p <0,01; = P <0,001. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: бактеріальні збагачення в ізольованих phagosomes. Збагачення mCherry тегами S. typhimurium в ізольованих phagosomes, зібрані після 30 хв і 4 h інфекції був у порівнянні з цитозольних фракції. Β-актину був використаний як елемент управління завантаження. Негативний контроль відноситься до phagosomes, ізольовані за допомогою крейдованого S. typhimurium на 30 хв після інфекції. Як очікується, остаточний висновок фагосоми ізоляції за допомогою немічених S. typhimurium не уявляють значна кількість mCherry або β-актину, демонструючи специфіку протоколу. 20 мкг білка був завантажений на семпл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 5: Аналіз endosome і лізосомальних маркерів в ізольованих S. typhimurium -містять phagosomes. Збагачення endosome маркери Rab5 і Rab7 і лізосомальних маркери v АТФази (0 V і V1 підрозділу) і катепсина D був проаналізований в ізольованих S. typhimurium -містять phagosomes, витягнутих після 30 хв і 4 h інфекції. Β-актину був використаний як елемент управління завантаження. 20 мкг білка був завантажений на семпл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 6: Аналіз і мітохондрії, ER, цитозольних маркерів в ізольованих S. typhimurium -містять phagosomes. Цитозольний маркер GAPDH, calnexin маркер ER і мітохондріального маркера Tomm20 в S. typhimurium phagosomes, ізольовані на 30 хв і 4 h після інфекції були проаналізовані immunoblotting і в порівнянні з відповідним цитозольних фракції. 20 мкг білка були завантажені на семпл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 7: Мікроскопічні аналіз GFP - S. aureus заражені макрофаги. BMDMs були інфіковані S. золотистого стафілокока, висловлюючи Зелений флуоресцентний білок (ГПУП) позначені wiй біотину, як описано в методології для маркування S. typhimurium. Після дозволяючи макрофаги фагоцитують бактерій на 30 хв, клітини були виправлені. Неглазуровані S. aureus ( «Не біотінілірованние S. А.») були використані в якості негативного контролю. Після фіксації і permeabilization клітин зразки інкубували з Cy5-стрептавідину 20 хв при 4 ° C. Флуоресцентний сигнал від ядра (DAPI), GFP - S. золотистого стафілокока і Cy5-стрептавідину були проаналізовані confocal мікроскопії. Сигнал від Cy5-стрептавідину можна побачити тільки в раніше помічені біотин, що підтверджують ефективне biotinylation бактерій. Масштаб барів = 10 мкм. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 8: Аналіз endosome і лізосомальних маркерів в ізольованих S. стафілокок -містять phagosomes. Ф. стафілокок -містять phagosomes, ізольовані на 30 хв, 2 h і 4 h після інфекції, були проаналізовані immunoblotting для phagosomal маркерів Rab5, Rab7 і v АТФази, в порівнянні з відповідним цитозольних фракції. 20 мкг білка були завантажені на семпл. Зразки були також протестовані з специфічним антитілом проти GAPDH, демонструючи, що ізольовані S. стафілокок -містять phagosomes вільні від цитозольних забруднення. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.