Оптогенетики: найсвітліші думки

Миша з вбудованим в мозок оптоволокном для доставки світла. Фото: http://bioeng.psu.edu/labs/Zhang-Lab/Research.html (Університет штату Пенсільванія, США).

Стану спокою і збудження нейрона визначаються різницею в концентрації позитивних іонів K + і Na + всередині клітини і за її межами. У стані спокою позитивні іони K + ефективно виводяться з нейрона за рахунок дифузії (А).

За допомогою оптогенетики дослідники можуть управляти нейронами, використовуючи світло. Малюнок зі статті Lizzie Buchen // Nature, vol. 465, 6 may 2010 року.

Нейрон, підготовлений для управління світлом. Світлочутливі іонні канали клітини містять ділянку, флуоресціюючий зеленим світлом.

<

>

В очікуванні нового методу

Роботу будь-якої системи зручно вивчати, по черзі вимикаючи окремі її частини. Таким способом можна виявити ті з них, що важливі для роботи всієї системи. Визначивши ключові елементи системи, корисно навчитися ними маніпулювати, тоді ми зможемо управляти процесом на свій розсуд і вивчати його в деталях. Однак коли мова йде про дослідження нервової системи, застосування такого підходу стикається з серйозними труднощами.

У мозку людини знаходиться близько 80 мільярдів нейронів, що утворюють складні розгалужені мережі. Вважається, що кожна окрема нейронна мережа може визначати якусь елементарну функцію. Взаємодія цих мереж в різних зонах мозку забезпечує складну нервову діяльність. Довгі роки про функції структур мозку судили по порушеннях, які з'являлися при пошкодженні його ділянок, або по тому, які зони мозку активні при виконанні випробуваним різних завдань.

Цікаві результати були отримані в експериментах на тваринах, в мозок яких імплантували електроди, щоб штучно порушувати ті чи інші ділянки мозку. На тварин проводили і дослідження з використанням хімічних речовин, здатних вибірково гальмувати роботу нейронів певного типу. Однак кожен з цих методів має суттєві недоліки: або дію одночасно на велику кількість нейронів, або низьке временн? Е дозвіл. Навіть найменший вживлені в мозок електрод невибіркову збуджує всі навколишні його нервові клітини, а найсучасніший хімічний інгібітор діє набагато довше, ніж природні стимули.

інструментарій

Ідею управляти нейронами «точково» вперше чітко висловив в 1979 році Френсіс Крік (який отримав Нобелівську премію за відкриття структури ДНК). Через двадцять років, в 1999-му, він запропонував використовувати для збудження нейронів світло. Світлове випромінювання має багато переваг: воно швидко досягає об'єкта, його легко дозувати і представляти у вигляді коротких імпульсів. У 2005 році група дослідників зі Стенфордського університету під керівництвом Карла Діссерота зуміла викликати збудження нервових клітин, опромінюючи їх світлом. Для цього нейрони довелося піддати генно-інженерних маніпуляцій. Новий метод отримав назву оптогенетики і за останні роки викликав справжню революцію в дослідженнях нервової системи.

Щоб нейрон став світлочутливим, він повинен мати білок - рецептор світла. Приклад нейронів, чутливих до світла «від природи», - клітини сітківки ока. Вони містять рецептор родопсин, який складається з білка, званого опсин, і кофактора ретиналю - похідного вітаміну А. Під дією світла ретиналь змінює свою структуру, і ці зміни передаються на білок, який активує сигнальні шляхи нейрона, що викликають його збудження. У спокої нейрон заряджений негативно: всередині клітини концентрація натрію та інших позитивних іонів мала. При порушенні включаються іонні канали в зовнішній мембрані нейрона, закачує позитивний натрій всередину. Заряд всередині клітини стає позитивним. В такому стані нейрон збуджений і готовий передати сигнал іншим нейронам в мережі.

Перші спроби створити нейрони, керовані світлом, полягали в перенесенні в них опсінових генів ссавців. Читання нового гена в таких нейронах призводить до синтезу світлочутливого білка. Ці роботи, що проводилися на початку 2000-х, мали дуже обмежений успіх. Під дією світла штучні нейрони з родопсином активувалися повільно і нестабільно. Сигнальні системи нейронів не призначені для взаємодії з родопсином. Здавалося, оптогенетики, ледь виникнувши, зайшла в глухий кут. Рішення прийшло несподівано.

Не тільки тваринам потрібно відчувати світло. Світлочутливими рецепторами володіють, наприклад, одноклітинні водорості. Їх «зір» також засновано на роботі родопсином. Чудова властивість цих білків полягає в тому, що вони не тільки сприймають світло, але і самі грають роль іонних каналів і викликають збудження клітини. Тому їх прийнято називати канальними родопсином. Виявилося, що ці білки працюють набагато стабільніше родопсином ссавців. Нейрони, що несуть їх на своїй поверхні, дають швидкий і точний відповідь на світлове випромінювання. Перший канальний родопсин відкрили американці Д. Остерхельт і В. Стокеніус в 1971 році, але пройшло більше 30 років, перш ніж родопсином мікроорганізмів і нейрони ссавців «зустрілися». В ході досліджень родопсином мікробів відкрили цілий ряд світлочутливих білків з різними властивостями. Одні з них проводять іони натрію, інші - відразу кілька типів позитивних іонів. Є родопсином, навпаки, виводять позитивні іони з клітин. Вони здатні знімати збудження. Таким чином, можна не тільки цілеспрямовано активувати, а й вимикати нейрони. На особливу увагу заслуговують родопсином, що сприймають світло з різною довжиною хвилі. Це дозволяє одночасно і незалежно управляти різними групами нейронів за допомогою, наприклад, синього і червоного світла.

У 2002 році біологи з Франкфурта описали новий родопсин одноклітинної зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii. Цей білок став першим канальним родопсином, використаним для управління нейронами. Спочатку обнадійливі результати були отримані на культурах клітин. Наступний крок - управління нейронами в мозку живого організму - став можливий завдяки розвитку генно-інженерних методів. У 2005 році, незабаром після експериментів з культурами клітин, група під керівництвом Хірому Яво з Університету Тохоку в Японії провела експеримент з мозком живої миші.

Існують два способи доставити ген родопсина в клітини мозку. Перший передбачає отримання трансгенного організму. Так, наприклад, ген родопсина може бути вбудований в геном миші на стадії ембріонального розвитку, і тоді всі клітини тіла будуть його утримувати. Але працювати цей ген стане не у всіх клітинах, а лише там, де він буде активований. Активністю гена можна управляти. Зазвичай для цього в послідовності ДНК перед геном розміщують «керуючий» ділянку. Щоб ген активувався, ця ділянка повинен бути прочитаний білками клітини. Існують послідовності, які можуть бути прочитані тільки в клітинах певного типу. Сучасній генетиці відомі сотні таких сигналів для різних клітин і тканин, в тому числі і для різних типів нейронів. Є ряд чудових модифікацій цього підходу, що дозволяють використовувати бібліотеки трансгенних тварин (створені в інших дослідженнях) для націлювання родопсином в різні клітини нервової системи. Однак отримання трансгенної миші вимагає декількох місяців.

Другий спосіб доставки гена в клітини працює набагато швидше. У ньому використовуються віруси, що несуть ген родопсина. У разі введення в мозок досить великої кількості вірусу, що проникає в нейрони, напрацювання світлочутливих білків відбувається дуже ефективно. Генно-інженерні віруси, які використовуються для цих цілей, сильно змінені і не здатні розмножуватися. Вони ефективно проникають в клітини і напрацьовують в них родопсин, в іншому для організму експериментальної тварини вони нешкідливі.

Окреме завдання - доставка світла до нейронам, розташованим в глибині мозку. У більшості випадків для цього використовуються оптоволоконні світловоди. Джерелом світла може служити лазер або світлодіод. Конструкція пристроїв дозволяє гризуна вільно переміщатися в клітці, незважаючи на постійно підключений до голови кабель. З недавньої розробкою родопсина, який активується червоним світлом, завдання освітлення мозку спростилася. Червоне світло добре проникає в тканини і в ряді завдань при його використанні вдасться відійти від впровадження в мозок оптоволокна.

штучні спогади

Завдяки оптогенетики безліч питань, що стосуються роботи мозку, отримали шанс на рішення. Так, наприклад, високоточна прицільна активація або високоточна прицільне вимикання зон мозку дозволили картировать області, відповідальні за довгострокову і короткочасну пам'ять. Крім того, з'явилася можливість підійти до вивчення пам'яті з нової сторони.

Наше сприйняття навколишнього представлено в мозку поєднанням активних і бездіяльних нейронів. Спогад - це відтворення тієї комбінації збуджених нейронів, яка колись виникла. В одній з недавніх робіт, виконаних в Массачусетському технологічному інституті під керівництвом нобелівського лауреата Судзумія Тонегави, у мишей за допомогою світла викликали спогади і надавали їм нового змісту. Це дослідження засноване на класичному підході до вивчення пам'яті з використанням миші в якості модельного об'єкта. У центрі уваги знаходиться реакція страху на електричний шок, що виникає в кімнаті, де тварина колись його відчувало.

Уявімо собі миша в кімнаті А, тут вона поводиться зазвичай. Перенесемо гризуна в кімнату Б з іншим оточенням і піддамо слабкому електричному шоку. Тепер при кожному переносі в кімнату Б миша буде відчувати страх навіть без шоку. Оцінити страх в даному випадку досить просто: зазвичай дуже рухливий гризун групується і завмирає. Спогад про кімнаті Б асоціюється у тварини з больовим відчуттям. Нейробіологам вдалося зробити світлочутливими тільки ті нейрони, які активувалися під час перебування миші в кімнаті А. Комбінація світлочутливих нейронів в даному випадку - записане спогад про цю кімнату. Далі експериментатори викликали цей спогад за допомогою світла під час електричного шоку в кімнаті Б. Чи стала миша після цього боятися удару в кімнаті А, де ніколи раніше його не відчувала? Правильна відповідь: так.

Краса цієї роботи заснована на більш ранніх дослідженнях мозку, виявили в ньому ділянку, пов'язаний зі спогадами. Це гіпокамп. Саме з його нейронами проводилися маніпуляції в згаданому експерименті.

Повернення до сітківки

Отже, родопсином мікробів визнали вдалим інструментом для створення світлочутливих клітин. Але чи можна мікробні родопсином застосувати для лікування сліпоти? Існує спадкове захворювання - пігментний ретиніт, пов'язане з дегенерацією клітин сітківки ока. Воно викликає прогресуючу втрату зору. Ефективного лікування для пігментного ретиніт сьогодні не існує. Значна частина випадків цієї хвороби пов'язана з порушеннями в гені, що кодує родопсин. Цей ген важливий для роботи двох типів клітин-рецепторів в складі сітківки. Це палички, що володіють хорошою світлочутливістю, але не здатні забезпечувати кольоровий зір, і колбочки, що дозволяють розрізняти колір, але менш чутливі до інтенсивності світла. У хворих пігментним ретинітом клітини палички досить швидко гинуть, проте колбочки, втративши здатність сприймати світло, живуть ще довгий час. Чи є можливість замінити в останніх клітинах непрацюючий родопсин на світлочутливий білок з бактерій? Група дослідників з Швейцарії під керівництвом Ботонда Роська для відповіді на це питання використовувала канальний родопсин архей.

Існує мишача модель пігментного ретиніт. Якщо за допомогою вірусів внести мікробний родопсин в колбочки сітківки, у гризунів спостерігається часткове відновлення зору. У стандартних тестах такі миші демонстрували поліпшення орієнтації в просторі в порівнянні з хворими гризунами без терапії. Цікаво, що використаний в роботі мікробний білок, званий eNpHR 3.0 (вдосконалений галородопсін з Natronomonas pharaonis версії 3.0), - вже третя версія модифікованої вихідної молекули. Методами генетичної інженерії постійно ведеться удосконалення мікробних родопсином для поліпшення їх роботи в клітинах ссавців.

Перенесення такого методу лікування на людину - непростий крок, оскільки в ньому використовуються віруси. Потрібно багато додаткових контрольних експериментів, щоб показати повну нешкідливість цієї технології для людей. Проте автори показали ефективність роботи білка eNpHR 3.0 в ізольованих клітинах сітківки ока людини. Подібні роботи - серйозне просування до терапії хвороб, пов'язаних з втратою активності нейронів. Наприклад, якщо клітини, які постраждали під час нейродегенеративних захворюванні, зробити світлочутливими, їх роботу можна знову запустити, опромінюючи світлом.

Не тільки нейрони

Можливість управляти майже будь-якими групами нейронів в мозку породила нові експериментальні роботи, багато з яких стали справжнім проривом в своїй області. Але сьогодні додаток оптогенетики - це не тільки нейрони. Строго кажучи, до оптогенетики можна віднести будь-який метод, який передбачає активацію будь-якого процесу світлом, якщо можливість такої активації забезпечена методами генної інженерії.

На даний момент створені системи, в яких світло може управляти активністю гена, вимикати роботу білків або запускати клітинну загибель. Примітно, що в таких дослідженнях використовуються не тільки білки, які діють як іонні канали. Так, наприклад, отриманий білок, названий KillerRed (червоний кілер), що виробляє при опроміненні світлом активні форми кисню. Активний кисень здатний руйнувати будь-які органічні молекули. Опромінення червоним світлом клітини з досить великою кількістю білка KillerRed викличе її загибель. Втім, подібний метод можна використовувати не тільки для вбивства цілої клітини. За допомогою генетичних методів ділянку, що генерує активні форми кисню в невеликих кількостях, можна включити в будь-який клітинний білок. Тоді світло викличе інактивацію всіх таких білків в клітині, що дозволить судити про їх функції. Перспективною також може виявитися цілеспрямована доставка світлочутливих молекул в клітини ракових пухлин для їх знищення.

Ідея управління клітинами за допомогою світла народилася задовго до появи оптогенетики. Однак для її реалізації потрібно розвиток ряду областей науки, особливо генної інженерії. Цікаво спостерігати, як з незв'язаних робіт по вивченню світлочутливих білків мікробів і мозку ссавців виник метод, визнаний науковим співтовариством революційним. Об'єднавши кілька наукових областей, оптогенетики сьогодні сама стала двигуном технологій, що розробляються під її запити.