ІМУНОХІМІЧНИЙ ТЕСТ НА Альфа2-макроглобулин В ОЦІНКИ ІМУННОГО СТАТУСУ ЛЮДИНИ - Сучасні проблеми науки та освіти (науковий журнал)

бібліографічна посилання

1 Кривенцов Ю.А. 1 Носков О.І. 1 Осика С.В. 2 Крівенцева Л.А. 1 Коханов А.В. 1 Крівенцева М.Ю. 1

1 ГБОУ ВРО «Астраханський державний медичний університет МОЗ Росії»

2 Філія № 3, ФГКУ «413 Військовий госпіталь» Міноборони Росії

Розроблено оригінальний спосіб виділення та очищення альфа-2-макроглобуліну людини, що складається з послідовних етапів висолювання вихідного матеріалу сульфатом амонію 50-процентну насиченість, центрифугування при 6000 об / хв, іонообмінної хроматографії на DEAE-сефадексе А-50 і гель-проникаючої хроматографії на Toyopearl -65. На наступному етапі дослідження розроблена специфічна імунохімічний тест-система для визначення альфа-2-макроглобуліну методом ракетного електрофорезу в агарових гелі по Laurell з порогом чутливості 3,95 ± 0,19 мг / л. Розроблену тест-систему застосовували для визначення рівнів альфа-2-макроглобуліну в сироватках крові пацієнтів з хірургічної, терапевтичної та інфекційною патологією, що супроводжується вираженими змінами імунного статусу. Імунохімічний аналіз клінічного матеріалу показав достовірне підвищення середньої концентрації альфа-2-макроглобуліну при захворюваннях, що супроводжуються пригніченням імунного статусу, і достовірне зниження цього показника при захворюваннях, що супроводжуються патологічною активацією імунітету. Отримані дані свідчать про високий практичному значенні альфа-2-макроглобуліну як клініко-діагностичного маркера зміни імунного статусу.

альфа-2-макроглобулин

імунітет

иммуносупрессия

імуномодулятори

туберкульоз

лепра

опікова хвороба

системні хвороби

1. Бойко О.В. Біохімічні і иммунохимические маркери в діагностиці патологічних станів / О.В. Бойко, А.Х. Ахмінеева, Н.І. Гудінські // Фундаментальні дослідження. - 2013. - № 9. - С. 327-329.

2. Бойко О.В. Вікові зміни імунологічних, морфологічних і біохімічних показників репродуктивної системи чоловіків / О.В. Бойко, А.Х. Ахмінеева, Н.І. Гудінські, В.І. Бойко, Д.М. Козак // Успіхи геронтології. - 2014. - Т. 27, № 1. - С. 50-53.

3. Буравкова Л.Б. Імуномодулюючі властивості мезенхімальних стромальних клітин // Алергологія та імунологія. - 2015. - Т. 16, № 4. - С. 344-347.

4. Веремеєнко К.Н. Про наявність двох видів інгібіторів трипсину в сироватці крові / К.М. Веремеєнко, А.І. Кизим // Біохімія. - 2005. - Т. 29, вип. 1. - С. 132-137.

5. Зубаиров Д.М. Біохімія згортання крові. - М.: Медицина, 2008. - С. 176.

6. Кривенцов Ю.А. Вивчення рівня альфа2-макроглобуліну людини у хворих з опікової хворобою і аутоімунні захворювання / Ю.А. Кривенцов, Д.М. Нікуліна, А.В. Самсонов // Комбустіологія. - 2002. - № 12-13. - С. 18-20.

7. Топчієв М.А. Клініко-діагностичне значення пов'язаного з вагітністю альфа2-глікопротеїну при різних формах гострого апендициту / М.А. Топчієв, Ф.В. Орлов, Е.А. Кчібеков, Д.С. Паршин, Ю.А. Кривенцов // Астраханський медичний журнал. - 2011. - Т. 6, № 1. - С. 153-155.

8. Прохідна В.А. Особливості системних імунних реакцій у вагітних жінок з хронічним пародонтитом / В.А. Прохідна, Т.В. Гайворонська, І.М. Биков, Е.Х. Чібічян, А.С. Ломова // Алергологія та імунологія. - 2015. - Т. 16, № 3. - С. 264-268.

9. Удочкіна Л.А. Експериментальне виявлення критичних періодів в розвитку щитовидної залози // Фундаментальні дослідження. - 2006. - № 7. - С. 47-48.

10. Удочкіна Л.А., Нуржанова С.С. Критерії оцінки стану слизової оболонки ясен в різних періодах онтогенезу / Л.А. Удочкіна, С.С. Нуржанова // Астраханський медичний журнал. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 257-258.

11. Чаговець Е.М. Вплив альфа2-макроглобуліну на біосинтез ядерних білків в органах сублетальні опромінених тварин / Е.М. Чаговець, С.Є. Хипкий, І.Ф. Паскевич // Біологія. - 2006. - Т. 16, № 6. - С. 903-910.

Одним з перспективних маркерів зміни імунного статусу, на наш погляд, є альфа 2-макроглобулин (МГ). Це гликопротеид, що містить 9% вуглеводів, з молекулярною масою 720-820 кДа, pI - 5,4. Даний білок є одним з ключових інгібіторів протеїназ, які беруть участь в регуляції активності багатьох протеолітичних ензимів людського організму. Зв'язування протеїназ здійснюється певним фрагментом субодиниці МГ, не зачіпаючи каталитически активного центру ферменту [1; 3; 4; 9].

Приблизно на десятому тижні внутрішньоутробного розвитку рівень МГ в сироватці крові досягає 15% від рівня дорослого і поступово підвищується до нормальних (для дорослого) значень. Максимальний рівень відзначається до 1-3 років (приблизно 4,5 г / л), потім поступово знижується до стабілізації на рівні, характерному для дорослих до 25 років. Його концентрація у жінок приблизно на 20% вище, ніж у чоловіків. Середня концентрація МГ в плазмі крові дорослих людей становить 2,6-3,3 г / л [1; 3; 4].

Згідно з сучасними даними, альфа2-макроглобулин має істотне клініко-діагностичне значення. Він є вираженим маркером «гострої фази», концентрація якого тонко реагує на більшість гострих запальних захворювань. Достовірне підвищення рівня сироваткового МГ реєструється при нефротической патології, а також у випадках раннього відторгнення трансплантата. Високі концентрації білка виявлені у хворих на цукровий діабет, особливо при порушенні функції нирок. Зниження рівня МГ реєструється при вірусному гепатиті, гострому панкреатиті, ревматичному остеоартрозі, на ранніх стадіях опікової хвороби [2; 4; 5; 11].

Раніше нами було відзначено, що середня концентрація МГ в плазмі крові експоненціально зростає протягом вагітності, досягаючи максимуму в кінці її, що свідчить про безпосередню участь в процесі формування імунологічної толерантності вагітності [6; 7].

Крім того, доведено, що МГ володіє вираженою імуносупресивної активністю по відношенню до різних ланках імунної системи людини. Найбільш сильно виражено імуносупресивну дію білка по відношенню до лімфоцитів протягом вагітності, особливо в першому триместрі. Цей білок індукує здатність макрофагів і нейтрофілів мігрувати в ділянки запалення [4; 5; 8-10].

Відповідно до викладеними фактами логічно припустити, що МГ є активним компонентом процесів гуморального імунітету і, отже, може виступати в якості маркера змін і порушень імунного статусу людського організму.

З огляду на, що захворювання, що супроводжуються порушенням імунітету, складають великий пласт сучасної нозології, виявлення патогенетичних ланок імунного дисбалансу та розробка нових способів оптимізації якості діагностики подібних патологічних станів шляхом апробації та впровадження імунохімічного тесту на МГ, безумовно, є актуальним завданням сучасної медицини.

Мета дослідження: кількісний імунохімічний аналіз сироватковоїконцентрації МГ при ряді патологічних станів, що супроводжуються зміною імунного фону, і виявлення кореляції кількісних показників з перебігом патологічного процесу.

Матеріали і методи дослідження

Проведено кількісний імунохімічний аналіз рівня МГ в пробах сироватки крові 156 пацієнтів хворих з патологічною активацією і супресією імунітету, з них: хворі на туберкульоз - 36 осіб, лепри - 24, опікової хворобою - 38, з аутотрансплантацией після опіків - 11, системний червоний вовчак (ВКВ ) - 5, здорові донори (контрольна група) - 42.

При розробці способу виділення і очищення МГ застосовували методи висолювання глобулінів сульфатом амонію 40% -ної насиченості, центрифугування при 6000 об / хв, іонообмінну хроматографію на DEAE-сефадексе А-50 в ступінчастому висхідному градиенте іонної сили, робочий буфер 0,01 М трис- HCl, рН 7,2, гель-проникаючу хроматографію на Toyopearl-65, робочий буфер 0,15 М фосфатний, рН 7,4.

Кількісний аналіз альфа-2-макроглобуліну проводили методом ракетного електрофорезу в агарових гелі в варіанті Laurell CB і Merrill D. з використанням моноспеціфіческой самостійно отриманої тест-системи на цей білок. Визначення концентрацій МГ в біоматеріалу проводилося з розрахунку порога чутливості розроблених тест-систем.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням ліцензійного пакету прикладних програм статистичного аналізу Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.), з обчисленням середніх величин (М), середньої помилки середньої арифметичної (m), критерію Стьюдента (t), значущості відмінностей (p). Для оцінки груповий залежності проводили лінійний кореляційний аналіз Пірсона (коефіцієнт кореляції - r). Для оцінки статистичної значимості показників концентрації МГ у хворих з ВКВ використовували способи статистичного аналізу для малих вибірок.

Результати досліджень

На основі отриманих раніше даних про фізико-хімічні властивості МГ [6; 7] розроблено оригінальний алгоритм виділення та очищення цього білка. Вихідним біоматеріалом для цього служила сироватка крові вагітних жінок пізніх термінів (36-40 тижнів гестації), яку отримували в МУЗ «Клінічний пологовий будинок» м Астрахані. Спосіб очищення МГ включав послідовні етапи: висолювання вихідного матеріалу сульфатом амонію 40% -ної насиченості з подальшим центрифугуванням (6000 g), іонообмінну хроматографію на DEAE-сефадексе А-50 (робочий буфер 0,01 М трис-HCl, рН 7,2) в ступінчастому висхідному градиенте іонної сили, гель-фільтрацію на Toyopearl-65 (робочий буфер 0,15 М фосфатний, рН 7,4).

Контроль чистоти одержаних препаратів здійснювали шляхом аналітичного електрофорезу в поліакриламідному гелі (рис. 1).

Мал. 1. Аналіз чистоти отриманого препарату МГ методом електрофорезу в ПААГ.

1 - очищений препарат МГ, 2 - напівочищення препарат

Отримані вищеописаним способом очищені препарати МГ використовували для отримання антисироваток шляхом імунізації кроликів породи шиншила дробовими дозами чистого антигену з ад'ювантом Фрейнда за наступною схемою: ін'єкція включала суміш антигенного матеріалу з повним адьювантом Фрейнда в співвідношенні 1: 2. Суміш вводилася підшкірно в бічну поверхню тулуба тварини в 8 точок. Ін'єкції проводилися чотири рази з тижневим інтервалом. Забір крові здійснювався з крайової вени вуха тварини на 6-10-й день після останнього введення.

Якщо отримані антисироватки не були моновалентною, то для позбавлення від баластних антитіл проводили виснаження антисироватки методом афінної сорбції з фіксованими антигенами (ліофілізована плазма донора). Дана методика є власну модифікацію методу зв'язування білків з поліакриламідному гелем (Bio Gel P-200) при використанні глутарового альдегіду.

Абсолютну чутливість отриманих тест-систем визначали як приватна концентрації білка в очищеному препараті, визначеного біуретовим методом, і максимального робочого розведення тест-антигену.

В результаті проведеної роботи розроблені специфічні иммунохимические тест-системи на МГ, в яких тест-антигеном є сироватка крові вагітних жінок пізніх термінів (35-40 тижні) в робочому розведенні: 1/8, з порогом чутливості 3,95 ± 0,19 мг / л.

Отримані тест-системи використали, зокрема, для визначення рівня МГ методом ракетного електрофорезу в агарових гелі в варіанті Laurell CB і Merrill D. в клінічному матеріалі.

Порівняльний аналіз сироваткових концентрацій МГ показав значний розкид середніх показників в різних досліджуваних нозологічних групах (таблиця).

Рівні сироваткового МГ в досліджуваних групах

досліджувані групи

кількість проб

Середня концентрація МГ (М ± m) (мг / л)

Системна червона вовчанка

80,0 ± 0

туберкульоз

854,6 ± 92,4

лепра

451,2 ± 55,9

опікова хвороба

212,1 ± 27,8

Аутотрансплантація після опіків

121,7 ± 23,0

контрольна група

292,3 ± 35,3

Аналіз результатів по групі хворих з туберкульозом дозволив виявити достовірне перевищення середньої концентрації мг-854,6 мг / л, в порівнянні з групою контролю - 290 мг / л, (t = 6,2; p <0,01). Розподіл середніх величин МГ всередині групи, що обстежується хворих на туберкульоз теж мало певну закономірність: при дисемінованих формах туберкульозу і туберкульозі, ускладненому плевритом, середній вміст сироваткового МГ становило 342,9 мг / л (t = 3,9; p <0,05), при фіброзно-кавернозної формі - 946,7 мг / л (t = 6,8; p <0,005).

Середні показники МГ у хворих на лепру виявилися достовірно підвищені - 451,2 мг / л (t = 5,8; p <0,01). Хоча при даній патології підвищення досліджуваного білка не так значно, як при туберкульозі.

У пацієнтів з ВКВ середня концентрація МГ в сироватці крові дорівнювала 80 мг / л, що значно нижче середніх величин вмісту цього білка в контрольній групі (t = 5,1; p <0,01).

Контингент обстежуваних опікових хворих був представлений тільки пацієнтами з опіками III-IV ступенів і значною площею ураження без супутньої інфекційної і вегетативної патології. Аналіз отриманих результатів показав значне зниження (до 20 мг / л) рівня сироваткового МГ в початкові стадії опікової хвороби, нормалізацію концентрацій цього білка на 4-5-й день процесу і подальше підвищення його середніх значень до 600-700 мг / л до 10 15 дням опікової хвороби (t = 4,4; p <0,05) (рис. 2). Показана висока пряма кореляційна залежність між перебігом опікової хвороби і зростанням концентрації сироваткового МГ (r = 0,87).

Мал. 2. Динаміка зміни концентрацій МГ в сироватці крові при опікової хвороби

Досліджувалися також проби пацієнтів з аутотрансплантацией шкіри на тлі опіків тяжкого ступеня (III-IV). Середня концентрація сироваткового МГ у них становила - 121,7 мг / л, що значно нижче норми (t = 4,8; p <0,05).

Отримані дані свідчать про біологічну роль альфа-2-макроглобуліну як активного чинника імуносупресії, рівень сироватковоїконцентрації якого має зворотну залежність від ступеня активності імунного статусу організму людини (що суперечить наявним у літературі даними), і показують необхідність впровадження імунохімічного тесту на МГ в клінічну лабораторну практику для оптимізації діагностики та підвищення контролю якості лікування захворювань, що супроводжуються зміною імунітету.

висновки

1. Отримані дані свідчать про високе значення МГ як негативного маркера імунного статусу організму, концентрація якого підвищується при захворюваннях, асоційованих з імуносупресією (лепра, туберкульоз, розпал опікової хвороби), і знижується при патологічної активації імунітету (ВКВ, ранні стадії опікової хвороби).

2. Впровадження імунохімічного тесту на альфа-2-макроглобулин в клінічну практику дозволить оптимізувати діагностику та підвищити контроль якості лікування ряду захворювань, що супроводжуються зміною імунного статусу.

бібліографічна посилання

Кривенцов Ю.А., Носков О.І., Осика С.В., Крівенцева Л.А., Коханов А.В., Крівенцева М.Ю. ІМУНОХІМІЧНИЙ ТЕСТ НА Альфа2-макроглобулин В ОЦІНКИ ІМУННОГО СТАТУСУ ЛЮДИНИ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 3 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24622 (дата звернення: 15.05.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)

Ru/ru/article/view?