Тести на антибіотики в молоці: типи тестів і способи їх застосування.

1. Нормативні документи аналізу молока
2. Як антибіотики виявляються в молоці?
3. Якої шкоди приносять антибіотики?
4. Методи визначення наявності антибіотиків в молоці
5. люмінесцентні методи
6. електрохімічні методи
7. хроматографічні методи
8. 4sensor (Форсенсор)
9. пристрій форсенсора
10. Порядок роботи форсенсора
11. Візуальне зчитування результатів роботи форсенсора
12. Принцип дії форсенсора
13. Heatsensor
14. Readsensor

Молоко відноситься до основних продуктів харчування. Особливо важливо воно для дітей. Його якість контролюється на державному рівні. Для цього застосовуються різні методи і комплекси. Серед останніх найбільш популярним є експрес тест для визначення антибіотиків в молоці 4sensor (форсенсор) .

Нормативні документи аналізу молока

Межі змісту в молоці різних речовин вказані в багатьох документах. У ГОСТ Р 52090-2003 викладені основні вимоги за органолептичними та фізико-хімічними показниками, є посилання на ГОСТи з нормативами по сортності та іншим характеристикам (в даний час скасований, замість нього рекомендується користуватися ГОСТ 31450-2013 Молоко питне. Технічні умови). Мікробіологічні показники наведені в СанПин 2.3.2.1078-2001. Тут же зазначені граничні норми щодо вмісту радіонуклідів, мікотоксинів, пестицидів, антибіотиків та інших токсичних речовин. З 1.05.2014 р почав діяти Міждержавний технічний регламент ТР ТЗ 033/2013 «Про безпеку молока і молочної продукції». У ньому передбачено визначення в чотирьох груп антибіотиків.

Також прийняті ГОСТи по методиці виявлення в молоці шкідливих речовин:

• ГОСТ 32254-2013 Молоко. Інструментальний експрес-метод визначення антибіотиків

• ГОСТ 32901-2014 Молоко і молочна продукція. Методи мікробіологічного аналізу

• ГОСТ Р 51600-2010 Молоко і молочні продукти. Мікробіологічні методи визначення наявності антибіотиків

• ГОСТ 32219-2013 Молоко і молочні продукти. Імуноферментні методи визначення наявності антибіотиків (ГОСТ Р 53774-2010 з ідентичною назвою скасований).

Ухвалення перерахованих вище і багатьох інших документів необхідно з тієї причини, що молоко забруднюється небажаними для людини речовинами. Це відбувається, як неминуче, так і внаслідок недбалості виробників.

Серед шкідливих компонентів, які потрапляють в даний продукт, нерідко зустрічаються антибіотики.

Як антибіотики виявляються в молоці?

Корови хворіють досить часто. Лікують тварин різними ліками, в тому числі, антибіотиками. На сьогоднішній день у ветеринарній практиці використовується понад 50 різновидів препаратів цієї групи. В основному, вони застосовуються при респіраторних хворобах, маститі (в тому числі - для профілактики) і інфекційних захворюваннях. Прийняті медикаменти в результаті потрапляють в молоко, в якому присутні не в чистому вигляді, а в залишкових кількостях.

Крім того, для економії корму, інтенсивного збільшення живої ваги (різниця в прирості - до 30%) і стимуляції росту молодняку ​​теж застосовуються антибіотики. Їх включають в кормові добавки в субтерапевтических (тобто, в менших, ніж для лікування) кількостях. Але і ці препарати теж виявляються в молоці, до того ж, навіть в тих випадках, коли добавки вносилися мінімально.

Як показує практика, в фермерських господарствах, після одужання корови, її продукцію рідко перевіряють на наявність антибіотиків. За санітарними правилами, після того, як корівку пролікували, отримане від неї молоко треба зливати протягом від 5 до 10 днів (точний термін залежить від виду лікарського препарату). Здавати його на молзавод не можна! Проте, в періоди, коли в загальному по країні спостерігається брак даної сировини, фермери, щоб не втрачати прибуток, іноді виливають таке молоко в загальні бідони. Тобто, розбавляють його. В результаті, концентрація антибіотиків дійсно знижується, але, все одно, вони нікуди не зникають.

Якої шкоди приносять антибіотики?

Першими від наявності в сировині антибіотиків страждають виробники. Зазначені лікарські препарати є інгібіторами - вони сповільнюють процес сквашування, а то і зовсім припиняють його. Тому, якщо таке молоко потрапляє на лінію виробництва кисломолочних продуктів, то воно порушує хід технологічного процесу, через що компанія зазнає збитків. До речі, з цієї причини є непорушним той факт, що в кісломолочку антибіотики відсутні за визначенням.

Накопичення ліків в організмі будь-якого споживача молока і молокопродуктів, приносить велику шкоду здоров'ю людини. Знижується імунітет, може розвинутися алергія (в основному - через пеніциліну) або дисбактеріоз. За деякими даними - спостерігається збільшення ваги. Тетрациклін може стати причиною зниження апетиту, викликати проктит або гастрит, а також фотосенсибілізація шкіри (підвищену чутливість до УФ променів). Він шкодить печінці і здатний порушити склад крові. Стрептоміцин шкідливий для нервової системи. Левоміцетин, який ветеринари застосовують досить часто, пригнічує кровотворну систему.

Антибіотики пригнічують активність ферментів, змінюють мікрофлору людського організму, поширюючи її стійкі види. Кип'ятіння ці медпрепарати не бояться. У сухому молоці їх не менше, ніж у вихідній сировині, при сушінні вони не руйнуються.

Ще одна «бомба уповільненої дії» полягає в тому, що накопичення антибіотиків стає причиною виникнення стійкості (резистентності) організму по відношенню до медикаментів. Тому, якщо, при якому-небудь (зазвичай запальному) захворюванні, людини доведеться лікувати даними препаратами, вони виявляться неефективними.

Методи визначення наявності антибіотиків в молоці

Імунологічні та мікробіологічні методи

До імунологічних методів відносяться експрес тести на антибіотики в молоці . Їх дія заснована на аналізі інтенсивності реакції специфічних рецепторів - білків, пов'язаних з частинками золота. Технологія зручна, від лаборанта не потрібно спеціальне хімічне освіту. Результат отримують швидко, в середньому на дослідження потрібно від 5 до 10 хвилин. Пристрій, що зчитує не обов'язково, в деяких випадках треба застосовувати інкубатор, для створення необхідної температури проби в межах від + 40 до + 50 град С. Аналіз можна робити в польових умовах, термостати підключаються до джерела живлення 12 / 24В. Кожен тест розрахований на визначення однієї або декількох (до чотирьох) груп антибіотиків.

В основу інгібіторних мікробіологічних методів покладено вплив антибіотиків на штами мікроорганізмів. Наявність медпрепаратів в молоці виявляється при дифузії їх в агар - визначенням інтенсивності гальмування розвитку тестових культур, які були внесені в живильне середовище.

Молоко поміщають в Віален (невеликі, від 0,3 до 20 мл скляні або пластикові лабораторні флакони) з живильним середовищем. У ній міститься штам бактерій Bacillus strearothermophius calidolactis. А також індикатор кислотності. При зростанні або зниженні рН, він змінює забарвлення середовища, по якій визначають наявність антибіотиків в пробі.

Віален инкубируют 3 години при Т = 64 град С. Якщо в пробі антибіотиків немає, то бактерії швидко розвиваються, кислотність змінюється, а разом з нею - і колір середовища. Якщо ж медикаменти в молоці є, то вони пригнічують ріст бактерій, рН не змінюється, колір середовища залишається таким же, як на початку аналізу.

Перевага подібних тестів полягає в можливості протягом одного дослідження виявити повний спектр антибіотиків та інших інгібіторів. Недолік - порівняно довгий час роботи, обов'язкове застосування інкубатора. Такий спосіб більше підходить для переробних підприємств, а не для фермерів. Вартість ингибиторного мікробіологічного методу нижче, ніж експрес-тесту.

люмінесцентні методи

Ці методи засновані на сенсибілізованої люмінесценції іонів Tb (III) і Eu (III). Зазвичай вони застосовуються для визначення медпрепаратів хинолонового і тетрациклінового ряду. Органічні ліганди, до яких відносяться і антибіотики, характеризуються високими молярними коефіцієнтами поглинання. Вони інтенсивно вбирають енергію збудження. При цьому, якщо енергія лиганда в тріплетном стані більше, ніж той же параметр іона лантаніди на резонансному рівні, то вона може йому передаватися. Іон збуджується і починає випромінювати кванти світла.

електрохімічні методи

Такі способи застосовуються для виявлення медикаментів тетрациклінової групи. Використовується ионометрия і амперометричне титрування. Іонні асоціати антибіотиків, з гетерополіаніонамі структури Кеггіна, виступають в ролі електродно-активного компонента мембран іонселективного електродів. При амперометричного технології титрантом є 12-молібдофосфорная кислота. Перевагами методики є її селективність, простота проведення і висока чутливість.

хроматографічні методи

Технології даної групи засновані на визначенні зміни інтенсивності молекулярної постколоночной люмінесценції антибіотиків (в основному, тетрациклінового ряду), яка посилюється при утворенні комплексів з катіоном цирконію (IV). Найефективнішим вважається метод ВЕРХ з ультрафіолетовим або флуоресцентним детектуванням.

У молочній промисловості застосовуються, в основному, імунологічні та мікробіологічні тести. До першої групи належать інкубаторні і безінкубаторние способи.

4sensor (Форсенсор)

призначення форсенсора

Тести на антибіотики в молоці 4sensor (Форсенсор) є одним з найбільш популярних в даній групі з тієї причини, що з їх допомогою можна одночасно визначити наявність відразу чотирьох медикаментів: β-лактамних типу (пеніциліну і цефалоспорина), тетрациклінової групи, левоміцетину (хлорамфеніколу) і стрептоміцину.

Набір розрахований на роботу з різними видами сировини - не тільки з натуральним молоком, але також з пастеризованим або сухим. Останнє в кількості 10 г змішується в 90 мл підігрітої до 40 град С дистильованої води. Можна досліджувати сироватку, в тому числі, суху. Кисле молоко перевіряти не можна.

Даний комплект включений в якості тест-набору №7 в ГОСТ 32219-2013 «Молоко і молочні продукти. Імуноферментні методи визначення наявності антибіотиків »(пункт 3.10, виноска №7). Одна упаковка розрахована на 96 тестувань.

пристрій форсенсора

Тести на антибіотики в молоці 4 сенсор складаються з двох компонентів:

• Мікролунка (пробірка), для проби молока. У ній є певна кількість моноклональних білкових антитіл (рецепторів), мічених колоїдним золотом.

• Тест - смужка хроматографічного паперу. Вона являє собою набір мембран з лініями зв'язування. Кожна мембрана налаштована на певний вид антибіотиків.

Так як в процесі аналізу проба молока повинна бути підігріта до 40 град С, то для роботи з комплектом потрібен інкубатор-термостат. Виробник рекомендує застосовувати тільки Heatsensor. Решта, як сказано в інструкції до набору, не підходять. У тому ж документі говориться, що, якщо інкубатор відсутня, можна користуватися водяною банею.

Зчитування даних виконується двома способами: візуально або за допомогою спеціального апарату Readsensor. Другий метод дозволяє виконати діагностику більш точно, а також зафіксувати результати досліджень.

Порядок роботи форсенсора

• включити інкубатор Heatsensor . Його можна буде використовувати після того, як температура підніметься до 40 град С. На це потрібно близько 10 хвилин.

• Поставити мікролунку в термостат.

• У пробірку з реагентами піпеткою додати 0,2 куб. см. молока. Перемішати його до гомогенізоване стану. Проба повинна бути однорідною і рідкої, без розшарування на фази, осаду або згустків. Для перемішування треба 5 разів наповнити лунку і злити вміст за допомогою піпетки. Якщо пробірок кілька, то для кожної на піпетці повинен бути «свій» наконечник. Рекомендована температура сировини до приміщення в інкубатор - від 4 до 20 град С. Змішувати треба швидко, так як, після додавання молока в мікролунку, між розташованими в ній хімічними речовинами і пробою починається реакція.

• Закрити кришку інкубатора. Натиснути кнопку «Старт». Дії пп. 3 і 4 теж слід виконувати максимально оперативно.

• Після закінчення 5 хвилин (цей період називається перша інкубація, відлік ведеться за допомогою вмонтованого в Heatsensor таймера), лунають звуковий і світловий сигнали. Вимкнути установку.

• Помістити в мікролунку тест-смужку.

• Знову натиснути «Старт». Продовжити нагрів протягом ще 5 хвилин (друга інкубація).

• Після закінчення, вимкнути прилад, вийняти тест-смужку і покласти її на аркуш паперу. Прочитати результат. Це треба зробити протягом 5 хвилин після закінчення аналізу, не пізніш (не залежно від того, візуально або за допомогою Readsensor). Якщо підсумки позитивні, їх треба підтвердити додатковим дослідженням.

Візуальне зчитування результатів роботи форсенсора

Починати розшифровку необхідно з перевірки наявності контрольної лінії вгорі смужки. Якщо її немає, аналіз слід вважати недійсним. Якщо є, тоді перевіряють тестові лінії - по черзі, зверху вниз: тетрациклін, левоміцетин, стрептоміцин, бета-лактами. Перевірка полягає в порівнянні інтенсивності колірного фарбування двох ліній - контрольної і тестової, що відповідає певному антибіотика.

Якщо колір тестової лінії більш інтенсивний, ніж контрольної, це означає, що результат - негативний. Даний антибіотик в пробі молока відсутня, або міститься на більш низькому рівні, ніж наведено в довідковій таблиці. Якщо ж тестова світліше, ніж контрольна, рівна їй або зовсім відсутня, то - позитивний. Кількість цього препарату відповідає нормативному або більше даного значення.

Таким способом треба перевірити стан всіх тестових смуг. Якщо з якоїсь з них неможливо зрозуміти, світліше вона або така ж, як контрольна, значить, результат по ній вважається позитивним і вимагає повторного дослідження.

Принцип дії форсенсора

В основу технології покладено комплексоутворююча реакція антибіотиків чотирьох зазначених вище груп з міченими колоїдним золотом білковими рецепторами. Після проведення аналізу, проводиться візуальне, або за допомогою спеціального апарату, визначення наявності рецепторів, які залишилися вільними.

Чим більше їх залишилося вільними, тим, значить, менше частинок антибіотиків вступили з ними в реакцію, тим нижче вміст медикаменту в молоці і, як наслідок, тим більше інтенсивним виходить колір відповідної тестовій ділянці. Якщо ж медпрепарату «багато», то його частки пов'язують все або майже все рецептори. Так як вільних рецепторів залишається «мало» або немає зовсім, то тестова лінія забарвлюється ними слабко або зовсім не видно.

Після того, як молоко наллють в мікролунку в термостаті і включать прилад на першу інкубацію, що знаходиться в пробірці реагент суспензії з пробою. Моноклональні антитіла (рецептори) зв'язуються з речовинами, які перевіряються на наявність в молоці (тобто, з антибіотиками).

Через 5 хвилин нагріву апарат вимикається, і в лунку поміщають тест-смужку. Проверяемая рідина починає підніматися по смужці, проходячи через розташовані на ній зони поглинання. Якщо шуканих антибіотиків в молоці в достатній кількості немає, то в цих зонах повинні з'явитися кольорові лінії. Якщо є, то лінії виявляться блідими або не з'являться зовсім, в залежності від концентрації відповідного медпрепарату.

Heatsensor

HeatSensor DUO APP032 - це портативний інкубатор-термостат для роботи експрес-методом з усіма тестами Unisensor. Розрахований на одночасне дослідження 2-х проб.

Його основним вузлом є металевий нагрівач, розташований в пластиковому корпусі. Тепловий блок працює за методом електромагнітної індукції. Підтримує оптимальну для аналізу температуру 40 град С, з точністю до плюс-мінус 3 град С. По закінченню терміну інкубації, включається світловий і звуковий сигнали. Смужки викидаються автоматично. Дані виводяться на дисплей.

У продажу є HeatSensor OCTO APP052, призначений для одночасної роботи з 8-ю пробами. А також HeatSensor AERNE 230V APP004 - на 24 проби.

Readsensor

Readsensor АРР038 / АРР039 - це пристрій, що зчитує пристрій, призначений для точного визначення наявності антибіотиків з досліджень, проведених за допомогою будь-яких тест-смужок Unisensor. Працює автономно або з комп'ютером. Значно спрощує визначення результатів і робить його більш точним. Може відправити дані на міні-принтер.

У приладу є кілька опцій, які вибираються, в залежності від середовища і умов аналізу. Передбачено 2 робочих режиму: тривалий і швидкий (останній запрограмований за замовчуванням). У першому випадку треба ввести всі свідчення оператора і реагентів. У другому - тільки номер проби.

Справа на приладі є висувна осередок з отвором (прорізом) в центрі. У неї вставляється тест-смужка. Щоб молоко з індикатора не потрапило в оптичну частину апарату, просочений рідиною фільтр треба видалити.

Результати з'являються на дисплеї через 10 секунд після установки смужки в клітинку і включення пристрою в режим зчитування.

Регулярне і повсюдне використання експрес-тестів , Як і інших технологій визначення антибіотиків у молоці, є надійним бар'єром для проникнення медпрепаратів в організм людини через продукти харчування. В кінцевому підсумку, це важливий елемент здорового способу життя населення країни.