Вивчення комплексу антибіотиків феназинового ряду від культури синьогнійної палички | Aspirans.com | наукові статті, публікація (журнали ВАК, Scopus, ISI Web of Knowledge)

Вивчення комплексу антибіотиків феназинового ряду від культури синьогнійної палички

Пальчевська Катерина Сергіївна

Національний дослідницький Томський політехнічний університет

анотація

Феназин представляють собою групу гетероциклічних азотовмісних сполук, що показують широкий спектр антибіотичних властивостей. Феназин інтенсивно вивчаються для їх подальшого застосування в лікуванні хвороб рослин. Синьогнійна паличка продукує два феназинового з'єднання як вторинні метаболіти. Ці метаболіти ідентифіковані як феназин-1-карбонова кислота (PCA) і 2-гідроксіфеназін (2-ОН Р). У даній роботі виділення і вивчення комплексу феназинов було зроблено за допомогою тонкошарової хроматографії (ТШХ), колонкової хроматографії, УФ-спектрофотометрії та спектроскопії ядерного магнітного резонансу. Було вивчено вплив різних мінеральних солей на продукцію феназинов.

Abstract

Phenazines represent a group of heterocyclic nitrogen-containing compounds showing a broad spectrum of antibiotic properties. Phenazines are studied extensively for their further application in plant disease management. Pseudomonas aeruginosa produce two phenazine compounds as the secondary metabolites . These metabolites are known as phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and 2-hydroxyphenazine (2-OH P). In this study separation and characterization of phenazines were done by using thin layer chromatography (TLC), column chromatography and ultraviolet (UV) spectrum and nuclear magnetic resonance spectroscopy. The effect of various mineral salts on production of phenazine was studied.

Ключові слова: феназин, синьогнійна паличка, виділення, ідентифікація

Keywords: Pesudomonas aeruginosa, phenazines, isolation, identification.

Вступ

В даний час актуальною проблемою рослинництва є боротьба із захворюваннями сільськогосподарських культур, збудниками яких є різні фітопатогенні гриби і бактерії. Використовувані методи хімічного захисту мають ряд суттєвих недоліків, оскільки їх застосування призводить до забруднення навколишнього середовища, накопичення токсичних сполук в продуктах харчування, що, безсумнівно, позначається на здоров'ї людей і тварин. Використання природних мешканців грунту в якості основних біоконтролірующіх агентів дозволяє усунути дані недоліки, а також сприяє її оздоровленню. У зв'язку з цим актуальним є використання найбільш активних штамів мікроорганізмів і продуктів їх життєдіяльності для боротьби з фітопатогенами, так як вони ефективні в дуже малих концентраціях, і для захисту рослин потрібна невелика кількість діючої речовини.

Особливе місце серед природних антагоністів, які мають комплексною біоактивністю (фунгіцидної, бактерицидної) належить ризобактерій, які також надають позитивний вплив на ріст рослин. Вони відомі як сприяють зростанню рослин ризобактерій (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR) .Вони належать до PGPR через здатність колонізувати коріння рослин і стимулювати їх зростання за рахунок зменшення частоти захворювань. Придушення захворювань включає в себе інгібування патогенів конкуренцією і / або шляхом антагонізму [1-2].

Найбільш перспективними і добре вивченими природними антагоністами фітопатогенних грибів і бактерій вважаються бактерії роду Pseudomonas, що синтезують антибіотики ароматичної природи, що пригнічують розвиток фітопатогенів [3].

Метою даної роботи є оптимізація умов культивування бактерій P.aeruginosa для підвищення виходу антибіотиків феназинового ряду.

До завдань роботи входить:

1. Виділення комплексу феназинов, що виділяється бактеріями P. aeruginosа, штам 67.

2. Аналіз якісного і кількісного складу виділених феназинов.

3. Вивчення впливу умов культивування на вихід комплексу феназинов.

4. Виявлення кофакторов і інгібіторів біосинтезу феназинов

Pseudomonas aeruginosa (P. Аeruginosа, синьогнійна паличка) - класичний представник роду Pseudomonas. Різні штами цих бактерій широко поширені в природі. До складу синтезованих забарвлених сполук різних типів, добре проникають в субстрат, входять сполуки феназинового і пиридинового ряду. P. aeruginosа може одночасно утворювати комплекс до 6 пігментів феназинового ряду, якісний і кількісний склад яких залежить від компонентів середовища, умов культивування, індивідуальних особливостей бактеріальних штамів і джерел виділення [4]. У порівнянні з типовими антіфунгальнимі препаратами, феназин мають більш широкий спектр дії. Вони перешкоджають розвитку не тільки фітопатогенних грибів, таких як Monilinia fructigena, Rhizoctonia solani, Alternaria solani, Septoria tritici, Fusarium oxysporum, Pythium myriotylum, Candida albicans та інших, а й цілого ряду фітопатогенних бактерій - Acidovorax avenae, Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris. Крім того з'єднання феназинового ряду покращують здатність рослин засвоювати мінеральні речовини з грунту [5-6].

Антибіотики феназинового ряду - велика група низькомолекулярних гетероциклічних азотовмісних сполук, синтезованих в ході реакцій ароматичного шляху, які розрізняються за своїми хімічними і фізичними властивостями в залежності від типу і розташування функціональних груп [7]. Бактерії є єдиним відомим джерелом природного феназин.

Як заступників до складу молекули феназин можуть входити різні функціональні групи. Найбільш поширені похідні феназин наведені на рисунку 1:

Малюнок 1 - Будова феназинового антибіотиків

R1, R2, R3 = 0 - феназин; R1: COOH- феназин-1-карбооновая кислота; OH- 1-оксіфеназін (геміпіоціанін); CONH2- феназин -1 карбоксамід (PCN) (оксіхлрорафін); R1 = О, R2 = СH3 - піоціанін.

R1 = COOH, R3 = OH - 2-оксіфеназін-1-карбонова кислота; R1 = COOH, R2 = CH3 - 5-метілфеназін-1-карбоксилат [8].

матеріали та методи

Об'єкт дослідження

У роботі використовувався штам Pseudomonas aeruginosa, з колекції лабораторії мікробіології Обласної клінічної лікарні P. aeruginosа, штам 67.

середовища

Для культивування P. aeruginosа, штам 67 були використані чотири середовища різного складу: середа для культивування гетеротрофних мікроорганізмів РСА (Plate Сount Аgar), синтетична мінімальному середовищі М-9 (Маніатіс і ін.), Середа Кінг В, що застосовується для культивування бактерій роду Pseudomonas , універсальна живильне середовище ГРМ-бульйон [9].

Таблиця 1 - Склади середовищ для культивування P. aeruginosа, штам 67

РСА

М-9

Кінг В

ГРМ-бульйон

пептони - 20 г / л

глюкоза - 10 г / л

NaCl - 5 г / л

KNO3 - 1 г / л

пептони - 16,5 г / л глюкоза - 2 г / л

NaCl - 2 г / л

NH4Cl - 4 г / л

KH2PO4 - 12 г / л Na2HPO4 - 23,3 г / л

пептони - 20 г / л гліцерин - 10 г / л К2HPO4 - 1,5 г / л MgSO4 · 7H2O - 1,5 г / л

панкреатичний гідролізат рибного борошна-8 г / л

пептони ферментативний-8 г / л

NaCl-4 г / л

Отримання культуральної рідини штамів P. aeruginosа

Отримання біомаси мікроорганізмів здійснювали шляхом періодичного культивування P. aeruginosа, штам 67 без аерації в темряві в колбах Ерленмейера об'ємом 50 мл при температурі 24 ˚С на чотирьох середовищах різного складу. Час культивування - 3, 5 і 7 діб.

Виділення феназинов з культуральної рідини

Екстракцію феназинов проводили на 3-й, 5-е і 7-е добу культивування за методикою, за основу якої було взято екстракція похідних феназин, запропонована MELevitch і ERStadtman [10].

Продуценти феназинов виділяють свої антибіотики в навколишнє середовище, тобто в культуральну рідину. Тому на першому етапі виділення феназинов відокремлювали біомасу клітин фільтруванням. Потім фільтрат підкислюють 2 н соляною кислотою до рН 1-2 і проводили дворазову екстракцію додаючи рівний обсяг етилацетату. Екстракти збезводнювали за допомогою сірчанокислого натрію.

Аналіз екстрактів феназинов

Поділ і очищення феназинового з'єднань здійснювалася методами тонкошарової та колонкової хроматографії. В якості рухомої фази використовували систему розчинників гексан - етилацетат (3: 2).

Елюат аналізували на наявність феназинов за допомогою УФ-спектрофотометрії, скануючи в діапазоні хвиль 190-600 нм. На основі даних оптичної щільності і молярних коефіцієнтів поглинання розрахували концентрації отриманих речовин, використовуючи закон Бера-Бугера-Ламберта. Також структури отриманих речовин визначали вимірюванням температур плавлення і за допомогою спектроскопії ядерного магнітного резонансу.

результати

При культивуванні P.aeruginosa, штам 67 на всіх середовищах спостерігалося утворення біло-сріблястою плівки на поверхні середовища. Зі збільшенням часу культивування товщина плівки збільшувалася, що говорить про зростання біомаси.

Екстракти, отримані від P. аeruginosa, штам 67 мали жовте забарвлення, характерне для феназинов, інтенсивність якого наростала зі збільшенням часу культивування мікроорганізмів.

В ході роботи було встановлено, що при екстракції феназинов з усіх чотирьох середовищ на 3-й день культивування в культуральної рідини знаходиться тільки одна речовина (феназин-1-карбонова кислота (РСА)), на 5-й і 7-й дні виявлені два речовини (феназин-1-карбонова кислота і 2-гідроксіфеназін (2-ОН-Р)).

Малюнок 2 - Концентрація феназин-1-карбонової кислоти в різних середовищах на 3-й день культивування

Малюнок 3 - Концентрація феназинов в різних середовищах на 5-й день культивування

Малюнок 4 - Концентрація феназинов в різних середовищах на 7-й день культивування

Оскільки концентрація феназинов на 7-й день культивування незначно більше, ніж на 5-й день, оптимальним часом культивування можна вважати 5 діб.

З отриманих даних видно, що концентрація феназинов, виділених із середовища Кінг В набагато більше, ніж з інших середовищ. Тому середовище Кінг В була обрана базою для створення модифікованої середовища, при культивуванні на якій P. aeruginosa, штам 67 можна отримати максимальний вихід антибіотиків феназинового ряду.

Середа Кінг В була модифікована з використанням добавок мінеральних солей різних концентрацій. Отримані середовища умовно назвали KB I, KB II, KB III, KB IV, KB V, KB VI. Схема модифікації середовища показана на рисунку 5. Всі солі вносилися в середу в концентраціях 1,5 г / л, 0,75 г / л, 0,375 г / л, 0,187 г / л, 0,094 г / л, 0,047 г / л.

Всі солі вносилися в середу в концентраціях 1,5 г / л, 0,75 г / л, 0,375 г / л, 0,187 г / л, 0,094 г / л, 0,047 г / л

Малюнок 5. Модифікація середовища Кінг В

Отримання культуральної рідини мікроорганізмів здійснювали шляхом періодичного культивування без аерації в темряві в колбах Ерленмейера об'ємом 50 мл при температурі 24 ˚С. Час культивування 5 діб. Екстракцію феназинов проводили на 5-ту добу культивування за методикою, описаної раніше.

При додаванні всіх мінеральних солей в Кінг В в концентраціях 1,5 г / л, 0,75 г / л, 0, 375 г / л, 0,187 г / л зростання мікроорганізмів не спостерігалося, отже, дані концентрації солей є згубними для синьогнійної палички . При додаванні солей в концентрації 0,094 г / л у всіх модифікованих середовищах фіксується підвищення продукції феназинов в порівнянні з середою Кінг В. Максимальна кількість продукованих феназинов спостерігалося при концентрації солей в середовищі 0,047 г / л. Вивчення продукції феназинов при менших концентраціях солей буде проводитися надалі.

Далі наведені діаграми залежності продукції антибіотиків феназин ряду від типу і концентрації мінеральних солей в середовищі. Прим .: 2-ОН-Р - 2-гідроксіфеназін, РСА - феназин-1-карбонова кислота.

Малюнок 6. Вплив солей на продукцію 2-гідроксіфеназіна

Малюнок 7. Вплив солей на продукцію феназин-1-карбонової кислоти

На рисунку 6 видно, що при додаванні в середу солей CuCl2 · 2H2O і ZnSO4 · 7H2O продукція 2-гідроксіфеназіна відсутня. З чого можна зробити висновок, що іони міді і цинку є інгібіторами біосинтезу 2-гідроксіфеназіна, в той же час NH4NO3 є кофактором даного процесу і дозволяє збільшити продукцію антибіотика в 2 рази. Імовірно, основну роль в цьому відіграє нітрат-іон.

На рисунку 7 показано, що підвищення продукції феназин-1-карбонової кислоти найбільше сприяє також присутність в середовищі NH4NO3. В даному випадку, ймовірно, основним кофактором є іон амонію. Найменший вплив на біосинтез феназин-1-карбновой кислоти надають Co (NO3) 2 і ZnSO4 · 7H2O.

висновки

1. У ході роботи було виділено і ідентифікований комплекс антибіотиків феназинового ряду бактерії P. aeruginosa, штам 67. Було встановлено, що найбільш ефективним методом виділення феназинов є дворазова екстракція. На основі спектральних даних і температур плавлення були встановлено, що даний комплекс представлений феназин-1-карбонової кислотою і 2-гідроксіфеназіном.

2. Була визначена залежність якісного і кількісного складу феназинов від часу культивування та складу живильного середовища. Виявили, що після трьох днів культивування в культуральної рідини синьогнійної палички знаходиться тільки феназин-1-карбонова кислота, яка є попередником похідних феназин. На 3-4-й дні культивування частина РСА перетворюється в 2-гідроксіфеназін, але при цьому триває продукція РСА. На 7-й день культивування активність продуцента незначна. Оптимальним часом культирование взяли 5 діб на середовищі Кінг В.

3. У роботі було вивчено вплив різних мінеральних солей на продукцію антибіотиків феназинового ряду від культури синьогнійної палички, виявлено інгібітори і кофактор біосинтезу феназинов. Так, іони міді і цинку є інгібіторами біосинтезу 2-гідроксіфеназіна. Встановлено, що присутність в середовищі солі NH4NO3 сприяє продукції феназин-1-карбонової кислоти і 2-гідроксіфеназіна.

Список літератури:

Список використаної літератури 1. Zhang Y., Nakkeeran S., Fernando WGD Biosynthesis of antibiotics by PGPR and its relation in biocontrol of plant diseases // Biocontrol and Biofertilization & ndash; 2005. & ndash; Vol. 3. & ndash; P. 67 & ndash; 109. 2. Couillerot & nbsp; O., & Nbsp; Prigent-Combaret C., & Nbsp; Caballero-Mellado & nbsp; J., & Nbsp; Mo & euml; nne-Loccoz Y. Pseudomonas fluorescens & nbsp; and closely-related fluorescent pseudomonads as biocontrol agents of soil-borne phytopathogens. // Letters in Applied Microbiology. - 2009. - & nbsp; <a href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/lam.2009.48.issue-5/issuetoc"> Vol. 48. & nbsp; №5. - & nbsp; </a> Р. 505 & ndash; 512. 3. RJ Cook [et al.] Molecular mechanisms of defense by rhizobacteria against root disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. & Ndash; 1995. & ndash; Vol. 92, № 10. & ndash; P. 4197 & ndash; 4201. 4. В.В. Смирнов, Е.А.Купріянова Бактерії роду Pseudomonas // АН УРСР, Ін-т мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного. & Mdash; Київ: Наук, думка, 1990. & mdash; 264 с. 5. Whipps, JM Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere / JM Whipps // J. Experiment. Botany. & Ndash; 2001. & ndash; Vol. 52, № 1. & ndash; P. 487 & ndash; 511. 6. Боронін, А.М. Ризосферні бактерії роду Pseudomonas, що сприяють росту і розвитку рослин / А.М. Боронін // Соросівський освітній журнал. & Ndash; +1998. & Ndash; № 10. & ndash; С. 25 & ndash; 31. 7. Бріттон Г. Біохімія природних пігментів: пров. з англ. - М .: Світ, 1986. - 419 с. 8. Laursen JB, Nielsen J. Phenazine natural products: biosynthesis, synthetic analogues, and biological activity // Chem. Rev. & Ndash; 2004. & ndash; Vol.104. & Ndash; P. 1663 & ndash; 1685. 9. Price-Whelan A., Dietrich LEP, Newman DK Rethinking & laquo; secondary & raquo; metabolism: physiological roles for phenazine antibiotics. // Nat. Chem. Biol. & Ndash; 2006. & ndash; V. 2. & ndash; №2. & Ndash; P. 71-78. 10. ME Levitch, ER Stadtman // A study of the biosynthesis of phenazine-1-carboxylic acid & ndash; Archives of Biochemistry and Biophysics, 1964, Vol. 106, p.194-199. & nbsp; Додаткова інформація Телефон: 8-923-425-71-25 Поштова адреса: 634034, Росія, Томськ, вул. Котовського, д. 26, кв. 50 Дані про вуз: Національний дослідницький Томський політехнічний університет, Інститут фізики високих технологій, кафедра Біотехнології та органічної хімії Вчений ступінь: бакалавр за спеціальністю & quot; Біотехнологія & quot; Науковий керівник: доцент кафедри біохімії, к.м.н., Чубик Маріанна Валериановна E-mail: [email protected]