НОВІ МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ антитіл до ксантиноксидазу І ГУАНІНДЕЗАМІНАЗЕ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ КЛІНІКО-імунологічні ВАРІАНТІВ системний червоний вовчак

1. бібліографічна ПОСИЛАННЯ

1 Александров А.В. 1 Альохіна І.Ю. 1 Шилова Л.М. 2 Александрова Н.В. 1 Ненашева Н.В. 1 Ємельянов Н.І. 2 Мозгова Є.Е. 1 Александров В.А. 1 Ємельянова О.І. 1

1 ФГБНУ «Науково-дослідний інститут клінічної та експериментальної ревматології»

2 ГБОУ ВПО «Волгоградський державний медичний університет» МОЗ РФ

Імовірно антитіла до ксантиноксидазу (КО) і гуаніндезаміназе (ГДА) можуть входити до складу циркулюючих імунних комплексів, що може призводити до підвищення їх рівня в крові хворих на системний червоний вовчак (ВКВ). Розширення спектру імунологічних методів діагностики ВКВ може бути забезпечено впровадженням в лабораторну практику імуноферментного методу на основі іммобілізованих ферментів в якості антигену. Було вивчено вміст антитіл до КО і ГДА у 60 хворих ВКВ. Найбільш високі рівні антитіл до КО відзначалися у хворих ВКВ з ураженням нирок (р = 0,024) і наявністю васкулопатії (р = 0,042), а антитіл до ГДА - у хворих ВКВ з ураженням печінки (р = 0,024), нирок (р = 0,016) і у хворих з вираженим цітопеніческім синдромом (р = 0,039). Поява антитіл до КО і ГДА в сироватці крові хворих ВКВ при ураженні різних органів і систем може свідчити про глибину порушення анаболічних і деструктивних процесів при даному захворюванні. Впровадження нових методів лабораторної діагностики ВКВ може бути використано для виявлення антитіл до ферментам в сироватці крові хворих, що дозволить більш точно судити про клініко-імунологічних варіантах захворювання і дасть додаткові можливості для своєчасної корекції терапевтичного впливу.

системна червона вовчанка

ксантиноксидаза

гуаніндезаміназа

антитіла

1. Гонтар І.П. Емульсійна полімеризація як метод, що модифікує ферменти зі збереженням біологічних властивостей їх наноструктур / І.П. Гонтарь, Г.Ф. Сичова, А.В. Александров, Л.Н. Шилова, Е.С. Сімакова, М.М. Ємельянов, М.М. Матасова, Л.А. Маслакова, А.Б. Зборівський // Бюлетень експериментальної біології і медицини. - 2010. - Т. 150. - № 12. - С. 715-719.

2. Заводовський Б.В. Системна червона вовчанка. Етіопатогенез та лабораторна діагностика // Довідник завідувача КДЛ. - 2012. - № 10. - С.9-24.

3. Заводовський Б.В. Вплив терапії ксидифона на гістохімічні показники хворих на системний червоний вовчак / Б.В. Заводовський, І.А. Зборівська, Є.Г. Трофимова, Л.Є. Сівордова // Науково-практична ревматологія. - 2005. - № 3. - С. 44.

4. Зборовська І.А., Ханов А.Г., Капустіна Е.А. Підручник практичної ревматології (Керівництво для лікарів). - Вид-во Войналович Олександр Володимирович. - Ростов-на-Дону, 2016. - 376 с.

5. Ільїн М.В. Клініко-патогенетичне значення визначення показників функціональної активності та апоптозу нейтрофілів у хворих на системний червоний вовчак / М.В. Ільїн, П.А. Мальцева, Е.В. Речкіна, Н.І. Коршунов // Практична медицина. - 2011. - № 52. - С.101-103.

6. Насонов Е.Л. Клінічні рекомендації. Ревматологія / під ред. Е.Л. Насонова. - М .: ГЕОТАР - Медіа, 2010. - 288 с.

7. Ревматологія: національне керівництво / під ред. Е. Л. Насонова, В. А. Насонової. - М .: ГЕОТАР-Медіа, 2008. - 720 с.

8. Реброва О.Ю. Статистичний аналіз медичних даних. Застосування пакета прикладних програм STATISTICA. - М .: Медіасфера, 2006. - 312 с.

9. Романова Н.В. Окислювальний стрес циркулюючих фагоцитів і ураження органів і систем при системний червоний вовчак // Фундаментальні дослідження. - 2005. - № 2. - С. 34.

10. Сорока Н.Ф. Апоптоз лімфоцитів периферичної крові у хворих на системний червоний вовчак: патогенетичні та клінічні аспекти / Н.Ф. Сорока, А.І. Свірновскій, А.Л. Рекун // Науково-практична ревматологія. - 2006. - № 4. - С. 44-52.

11. Ahsan H. Oxygen free radicals and systemic autoimmunity / H. Ahsan, A. Ali, R. Ali // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 131, № 3. - Р. 398-404.

12. Deshmukh US Mechanisms of autoantibody diversification to SLE-related autoantigens./ US Deshmukh, F. Gaskin, JE Lewis, CC Kannapell, SM Fu // Ann. NY Acad. Sci. - 2003. - Vol. 987. - Р. 91-98.

13. Gordon C., Update on systemic lupus erythematosus: autoantibodies and apoptosis / С. Gordon, M. Salmon // Clin. Med. - 2001. - № 1. - Р.10-14.

14. McConnell J., Neutrophils from systemic lupus erythematosus patients demonstrate increased nuclear DNA damage / J. McConnell, A. Crockard, A. Cairns // Clin. Exp. Rheumatol. - 2002. - № 20 (5). - P. 653-660.

15. Mevorach D. Systemic lupus erythematosus and apoptosis: a question of balance // Clin. Rev. Allergy Immunol. - 2003. - Vol. 25, № 1. - Р.49-60.

16. Uhlen M. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas / M. Uhlen, P. Oksvold, L. Fagerberg, E. Lundberg, K. Jonasson, M. Forsberg, M. Zwahlen, C. Kampf, K. Wester, S. Hober, H. Wernerus, L. Björling, F. Ponten // Nat. Biotechnol. - 2010. - Vol. 28 (12). - P.1248-50.

17. White S. Apoptosis in systemic lupus erythematosus / S. White, A. Rosen // Curr. Opin. Rheum. - 2003. - Vol. 15, № 5. - Р.557-562.

При системний червоний вовчак (ВКВ) багатьма дослідниками були відзначені генетично обумовлене недосконалість імунорегуляторних процесів і різні дефекти апоптозу, які здатні призводити до утворення широкого спектру антитіл і подальшого виникнення імунокомплексного запалення [5,6,7]. Для гомеостазу імунної системи контроль апоптозу має вирішальне значення, а широкий спектр аутоантитіл, який визначається в сироватці крові хворих ВКВ, обумовлений різноманіттям аутоантигенов, які звільняються і модифікованих в ході апоптозу [2,15,17]. Часто мішенню аутоімунних реакцій при ВКВ стають ферменти основних метаболічних шляхів організму - антиоксидантної системи та пуринового метаболізму. Одними з основних ензимів даних систем є ксантиноксидаза (КО, ЄС 1.1.3.22) і гуаніндезаміназа (ГДА, Е.С. 3.5.4.3).

Мета дослідження: удосконалення методів лабораторної діагностики за допомогою іммобілізованих магнітокерованих антигенних наносистем на основі ксантиноксидази і гуаніндезамінази для виділення клініко-імунологічних варіантів ВКВ.

матеріали та методи

У дослідження були включені 60 хворих ВКВ (основна група). Середній вік хворих ВКВ склав 36,32 ± 15,27 (М ± SD) років, серед хворих ВКВ переважали жінки (91,7%), більшість становили особи працездатного віку (90%), тривалість ВКВ склав 7,97 ± 7, 36 років, середній вік дебюту хвороби - 28,5 ± 13,2 років. Активність ВКВ оцінювали за допомогою індексів SLEDAI, ECLAM і за критеріями, запропонованими В.А. Насонової (низька - 9, помірна - 34, висока - 17 осіб). Пошкодження (незворотні зміни в стані здоров'я) вимірювали за допомогою індексу SLICC / ACR (таблиця). При оцінці перебігу ВКВ за критеріями В.А. Насонової були отримані наступні результати: у 2 пацієнтів мало місце гострий перебіг ВКВ, у 44 - підгострий, у 14 - хронічний.

Вихідні показники хворих ВКВ

показник

M

SD

95% ДІ для М

Вік дебюту хвороби (років)

28,6

13,18

25,19 ... 32,01

Тривалість хвороби (років)

7,97

7,35

6,07 ... 9,87

Активність: SLEDAI

8,93

5,74

7,45 ... 10,4

Активність: ECLAM

5,30

2,79

4,59 ... 6,01

Пошкодження: SLICC / ACR DI

1,95

1,71

1,51 ... 2,39

Примітка: М - середнє значення, SD - стандартне відхилення, ДІ - довірчий інтервал.

До контрольної групи увійшли 30 практично здорових осіб (донори обласної станції переливання крові) у віці від 18 до 40 років (20 жінок і 10 чоловіків, середній вік - 26,0 ± 5,6 років), що пройшли звичайне медичне обстеження.

Об'єктом досліджень служила сироватка крові. Антитіла до КО (анти-КО) і ГДА (анти-ГДА) визначали в сироватці крові за розробленою нами модифікованою методикою імуноферментного аналізу з використанням в якості носія імобілізованих магнітокерованих антигенних наносистем (АНС), а в якості антигену - комерційні препарати КО і ГДА ( «Sigma», США). Іммобілізацію проводили методом емульсійної полімеризації в потоці газоподібного азоту з включенням магнітного матеріалу в структуру поліакріламідного гелю [1]. Результати проведених досліджень враховували на багатоканальному мікропланшетном спектрофотометре при довжині хвилі 450 нм і виражали в одиницях оптичної щільності (Од). Результати вважалися позитивними при перевищенні в дубльованих зразках середніх показників оптичної щільності середніх значень нормальних сироваток (осіб контрольної групи) на 3 стандартних відхилення.

Загальноклінічні лабораторні дослідження виконувалися в клінічній лабораторії Міської клінічної лікарні № 25 (м Волгоград) уніфікованими методами відповідно до відомчими нормативними документами, що регламентують порядок їх проведення. Було проведено ряд імунологічних проб, що дозволяють охарактеризувати імунний статус хворих ВКВ, включених в дослідження (імуноглобуліни класів A, M, G, ревматоїдний фактор, циркулюючі імунні комплекси, антинуклеарних фактор, СРБ, антитіла до кардіоліпіну, антитіла до нативної ДНК і ін.). Аналіз вихідних клінічних та лабораторних даних хворих ВКВ показав, що ізольовані лабораторні показники не можуть бути використані як індикатори активності і тяжкості перебігу захворювання, отже, необхідно проведення максимально комплексного обстеження із залученням, по можливості, додаткових діагностичних тестів.

Статистичний аналіз експериментальних даних виконувався за допомогою програмного пакету «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA). Рівень статистичної значущості відмінностей порівнюваних показників встановлювали з використанням t-критерію Стьюдента; непараметрического U-критерію Манна - Уїтні і Т-критерію Уилкоксона. Результат вважався достовірним при р <0,05 [8].

Результати дослідження

У групі здорових осіб вміст (M ± SD) анти-КО склало 0,032 ± 0,022 Од, а анти-ГДА - 0,049 ± 0,021 Од. Позитивними вважалися результати, що перевищують рівень анти-КО> 0,098 Од і рівень анти-ГДА> 0,112 Од. У хворих ВКВ показники (М ± SD) анти-КО склали 1,31 ± 0,83 Од, анти-ГДА - 1,27 ± 0,82 Од. Кількість хворих ВКВ з підвищеним рівнем анти-КО і анти-ГДА склало 53,3% і 51,7%, відповідно. Підвищений рівень даних антитіл не був виявлений у жодного обстеженого в контрольній групі.

Зміст анти-КО і анти-ГДА досліджували в залежності від показників ВКВ, що характеризують розвиток патологічного процесу на всій його довжині.

Була встановлена ​​значуща зв'язок рівня анти-КО з пошкодженням, що визначаються за допомогою індексу SLICC / ACR: коефіцієнт кореляції склав 0,29 (р = 0,022). При порівнянні пацієнтів ВКВ, які не мали ушкодження (значення індексу рівні 0) (n = 15, 25%), з хворими, що мала будь-яку ступінь пошкодження (n = 45, 75%) вміст анти-КО було помітно нижче в першій групі хворих ( 0,097 ± 0,056 проти 0,14 ± 0,044; р = 0,041). При проведенні кореляційного аналізу був виявлений зв'язок анти-КО з тяжкістю ураження нирок (r = 0,31; p = 0,024), а також наявністю у хворих ВКВ цітопеніческім синдрому (r = 0,35; p = 0,012). Порівняння між собою груп хворих ВКВ, позитивних і негативних за наявністю анти-КО, продемонструвало статистично достовірне збільшення частоти виявлення ознак ураження нирок (р = 0,032) і ретикуло-ендотеліальної системи (р = 0,021), також була відзначена велика частка хворих з наявністю васкулопатії серед пацієнтів з наявністю антитіл до КО (р = 0,042).

Між рівнем анти-ГДА в сироватці крові хворих ВКВ і активністю патологічного процесу була виявлена ​​статистично значуща кореляція (індекс SLEDAI: r = 0,361, р = 0,012; індекс ECLAM: r = 0,333, р = 0,011). У хворих ВКВ також була відзначена негативна кореляція рівня анти-ГДА зі значеннями біохімічної активності гуаніндезамінази в сироватці крові (r = -0,35). Найбільш високі рівні анти-ГДА відзначалися у хворих ВКВ з ураженням печінки (р = 0,024) і у хворих з вираженим цітопеніческім синдромом (р = 0,039). Слід підкреслити, що в групі хворих ВКВ, позитивних по анти-ГДА, також статистично значимо частіше виявлялося ураження печінки (χ² з поправкою Єйтса = 18,95, р = 0,001) і анемія (χ² з поправкою Єйтса = 6,92, р = 0,009).

Обговорення отриманих результатів

Власні білки організму в нормальних умовах призводять, як правило, до розвитку природної толерантності, так як основні антигенні детермінанти цих білків розпізнаються Т-клітинами і не можуть викликати утворення антитіл [2]. У разі зміни конформації білка на його поверхні з'являються «приховані епітопи», тобто такі антигенні детермінанти, які не брали участі в процесі вироблення імунологічної толерантності, а, значить, розпізнаються як чужорідні антигени [12].

Однією з причин конформаційних змін структури білка можуть з'явитися активні форми кисню (АФК) і посилення перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). При ВКВ має місце накопичення АФК, вторинних вільнорадикальних продуктів, які активно реагують з молекулами в найближчому оточенні [11], а в результаті цих процесів відбувається посилення пероксидації мембранних структур і наростання дефектів в контролі апоптозу клітин. Відзначено, що розвиток патологічних процесів при ВКВ супроводжується порушенням регуляції апоптозу лейкоцитів [9] і нейтрофілів [14], причому зниження рівня апоптозу нейтрофілів супроводжується посиленням утворення активних форм кисню і зменшенням резервного потенціалу клітин [5]. Дефекти апоптозу призводять до посилення секвестрации аутоантигенов в апоптотичні тільця, що в результаті сприяє зриву толерантності, створення «нових епітопів» і, як наслідок, збільшення вироблення аутоантитіл. Надмірне утворення вільних радикалів при ВКВ викликає пошкодження мембран макрофагів, еритроцитів і інших клітинних структур [3], а також сприяє виходу в екстрацелюлярне простір багатьох біологічно активних речовин, в тому числі і ферментів, таких як КО і ГДА. Наявність антигенних властивостей у ферментів забезпечує відповідну реакцію при їх виході з клітки, а вплив різних чинників запалення посилює антигенні властивості ензимів, внаслідок окислення їх функціональних груп [4].

Підвищення активності прооксидантно КО (О-форма ферменту) внаслідок підвищення проникності мембран у хворих ВКВ сприяє виходу з клітин різних протеаз, що також супроводжується генерацією супероксидних радикалів і наростанням активності КО. Про вплив анти-КО на активність ферменту можна судити по виявленої нами прямої кореляції помірної сили (r = 0,49; p <0,001) між активністю ферменту і рівнем даних антитіл. Беручи до уваги також виявлену зворотну кореляцію високої сили (r = -0,64; p <0,001) між активністю КО і активністю ксантиндегідрогенази (КДГ, D-форма ферменту), можна припустити, що при ВКВ антитіла до КО надають певний вплив на трансформацію КО ↔ КДГ в бік збільшення освіти прооксидантно форми ферменту (КО, О-форма ферменту). Імовірно це вплив виражається в зміні функціональної активності КО, коли під впливом антитіл до КО відбувається посилення процесів трансформації D-форми ферменту в О-форму, що в результаті веде до істотного збільшення генерації супероксидних радикалів.

Особливий інтерес представляють отримані нами дані про залежність рівня анти-КО від наявності у хворих ВКВ різних клінічних проявів. При проведенні кореляційного аналізу був виявлений зв'язок анти-КО з тяжкістю ураження нирок (p = 0,024), а також наявністю у хворих ВКВ цітопеніческім синдрому (p = 0,012).

Поряд з цим, аналіз зв'язків рівня анти-КО з лабораторними та імунологічними показниками також дозволив виділити зв'язок слабкої й середньої сили з індикаторами ураження нирок при ВКВ - протеїнурією (r = 0,26; p = 0,037), лейкоцитурією (r = 0,36 ; p = 0,002) і еритроцитурією (r = 0,28; p = 0,021), що дозволяє розглядати анти-КО як додатковий індикатор червоного вовчака нефропатії. У проведеному нами дослідженні ураження нирок було вкрай різноманітно (від стійкої невираженою протеїнурії і микрогематурии до швидкопрогресуючого гломерулонефриту) і виявлялося у 24 (40%) хворих ВКВ, причому у переважної більшості (15 осіб) вовчаковий нефрит розвинувся протягом перших 6 років від початку захворювання , а у 12% хворих ураження нирок було першим проявом ВКВ. Слід зазначити, що найбільші діагностичні труднощі викликали хворі з ураженням нирок без імунологічних і морфологічних ознак ВКВ в перші роки захворювання.

ГДА вважається відносно органоспецифичность ферментом для печінки, тому будь-яка патологія даного органу, супроводжувана гепатоцелюлярним пошкодженням, призводить до підвищеного викиду ензиму в кров. У зв'язку з цим нами були досліджені активність ГДА і рівень анти-ГДА в сироватці крові 9 хворих ВКВ з ознаками патології печінки (зміна осадових проб, підвищення активності АлАТ, АсАТ, загального білірубіну, ультразвукові зміни в паренхімі печінки, гепатомегалія і ін.). У цієї групи хворих було відзначено збільшення показників як активності ГДА (р = 0,042), так і анти-ГДА (р = 0,034).

Одночасно Було проведено дослідження ферментатівної та імунологічної актівності ГДА у 16 ​​Хворов на хронічній гепатит, Пожалуйста показало достовірне Підвищення актівності ГДА в порівнянні з донорами (p = 0,036) и незначна Підвищення в порівнянні з хворими ВКВ з Ознака Ураження печінкі (p> 0, 05). Що ж стосується анти-ГДА, то у хворого з хронічнім гепатитом ми спостерігалі Відсутність статистично значущих відмінностей Із здоровими особами (р> 0,1) и достовірно нізькі значення в порівнянні з хворими ВКВ з Ознака Ураження печінкі (р = 0,006). У зв'язку з цим, при наявності печінкової патології у хворих ВКВ в скрутних випадках необхідно розглядати факт підвищення активності ГДА не тільки за рахунок активності патологічного процесу, а й внаслідок можливого ураження даного органу, орієнтуючись, в першу чергу, на рівень анти-ГДА і наявну клінічну картину захворювання.

Поява анти-ГДА в сироватці крові хворих ВКВ може свідчити про глибину порушення анаболічних і деструктивних процесів при даному захворюванні. Подальше вивчення анти-ГДА і з'ясування їх впливу на біохімічну активність цього ферменту у хворих ВКВ з позицій вивчення окремих ланок патогенезу захворювання і клінічного варіанта патологічного процесу здатне сприяти поліпшенню вибору методу терапевтичного впливу і контролю ефективності проведеної терапії.

Висновок

Механізми освіти аутоантитіл при системних захворюваннях сполучної тканини, таких як ВКВ, до теперішнього часу остаточно не визначені. Впровадження нових методів діагностики на основі АНС в лабораторну практику може бути використано для виявлення антитіл до ферментам, зокрема до ферментам пуринового метаболізму, в сироватці крові хворих ВКВ, що дозволить більш точно характеризувати різні клініко-імунологічні варіанти перебігу захворювання, і може надати додаткові можливості для своєчасної корекції терапевтичного впливу. В цілому, детальне вивчення процесів утворення антитіл до КО і ГДА може бути використано для складання більш повної картини імунологічних порушень, що становлять основу системних аутоімунних захворювань.

бібліографічна ПОСИЛАННЯ

Александров А.В., Альохіна І.Ю., Шилова Л.М., Александрова Н.В., Ненашева Н.В., Ємельянов Н.І., Мозгова Є.Е., Александров В.А., Ємельянова Про .І. НОВІ МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ антитіл до ксантиноксидазу І ГУАНІНДЕЗАМІНАЗЕ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ КЛІНІКО-імунологічні ВАРІАНТІВ системний червоний вовчак // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 3 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24616 (дата звернення: 11.06.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, что видають у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)