Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

Сонна артерія Тромбоз Модель
У мишей з C57BL6 тлі, ми рекомендуємо використовувати 7,5% FeCl 3 для лікування судини протягом 1 хв в якості відправної точки. Під обробкою 7,5% FeCl 3, межі пошкодженої області і нормальної стінки судини легко ідентифікуються під мікроскопом (див онлайн відео 1), припускаючи, що ендотеліальні шар був значно пошкоджений. Тромби утворюються відразу ж після обробки FeCl 3, і спостерігаються у всіх WT C57BL6 мишей 1 хв після травми. Спочатку отриманий тромби є нестабільними і їх частини, як правило, змиті потоком крові, тому що утворилися тромби стають менше в 2 - 3 хв після травми. Тромби починають збільшити з 3 - 4 хв після видалення фільтрувального паперу і ці пізніше сформовані тромби стабільні і, як правило, не вимиваються. Середня оклюзійні час становить 11,3 ± 3,16 хв у мишей C57BL6 (п = 14) при 7,5% FСТЕК 3 використовується 6,7,19 (рисунок 5А і онлайн - відео 1). У попередніх дослідженнях ми показали, що як зменшення і збільшення концентрації FeCl 3 зменшує різницю між антитромботического штамі мишей і мишей WT 6; Виходячи з нашого досвіду, лікування сонної артерії з 7,5% FeCl 3 протягом 1 хв достатньо, щоб задовольнити всіх наших цілей. Крім того, щоб перевірити функцію специфічних генів з використанням мишей з нокаутом 7,8,16,19,21, наступні чотири представницькі експерименти з використанням цієї моделі:

Внутрішньовенне Перфузія тканинного типу активатор плазміногену опосередкованого тромболізису
Активатор плазміногену тканинного типу (ДТЗ) є одним з FDA затверджених препаратів для лікування тромболізису в Сполучених Штатах 22. Таким чином, ми спостерігали ТАП-опосередкованого тромболізис в моделі тромбоз сонної артерії. тромбозініціірована з 7,5% FeCl 3 і дозволило сформувати протягом 5 хв перед ТАП (1 мг / кг маси тіла) вливають через яремну вену катетера (22GA). Як показано на малюнку 5В і онлайн - відео 2, тромб постійно збільшуються і займають близько 50% від світового потоку через 5 хв після травми. Тромби продовжував збільшити після ТАП перфузия припускаючи, що ДТЗ не впливає на активацію тромбоцитів і агрегації. Тромболізис почав близько 4 хвилин після ін'єкції ТАП. Було виявлено, що утворюються тромби пройти варіації розміру багаторазово протягом періоду спостереження 30 хв і без оклюзії судин відбулося в даному випадку. Ці дані ясно показують, що ТАП не може повністю пригнічувати утворення тромбу тромбоцит-опосередкованих, навіть якщо це призводить до тромболітичної терапії. Таким чином, ми припускаємо, що майбутні експерименти, що використовують -індуцірованное моделі артеріальний тромбоз FeCl 3 може бути використаний для оцінки тромболітичної та інших ад'ювантноїтерапії, які можуть мати важливе предentative вплив на формування тромбу.

Перфузія Par4 антитіл мишам Пригнічує Тромбоз
Протеаза активоване рецептор 4 (PAR4) є G білком рецептор (GPCR), на тромбоцити, який активується шляхом протеолітичного розщеплення його N-кінцевого exodomain 23 і в подальшому призводить до кроків у активації тромбоцитів. Лабораторія Nieman сформувала козячі поліклональні антитіла Par4 (CAN12), який націлений на аніонний кластер Par4, і затримує Par4 розщеплення, впливаючи тим самим на критичний крок для Par4 опосередкованої активації тромбоцитів 24. перфузії 1 мг / кг цього антитіла мишам C57BL6, ми виявили, що інгібування PAR4 розщеплення значно збільшував раз в окклюзионная утворення тромбу в 7,5% FeCl 3 індукованої сонної артерії тромбозу на експериментальній моделі (5С і онлайн відео 3). Це свідчить про те, що FeCl 3 індукований тромбоз модель збути використані для оцінки впливу антитромбоцитарних агентів і характеризують потенційні терапевтичні стратегії.

Наночастки опосередкованої Тромби-специфічне націлювання
Швидке видалення грудку, щоб відновити кровотік має вирішальне значення при лікуванні оклюзійних судинних захворювань, включаючи ішемічний інсульт та інфаркт міокарда. Системної доставки тромболітиків, таких як ДТЗ показано вище, може лизировать сформовану тромби, але не може повністю запобігти активацію тромбоцитів і повторної агрегації / оклюзію. Крім того, системна пряма поставка таких серинових протеаз агентів може привести до неизбирательного дії офф-мішені, що призводить до серйозних побічних ефектів, включаючи кровотечі. Лабораторії вересня Гупта розроблені синтетичні транспортні засоби доставки тромбоцитів надихнули на основі наночасток, які можуть зв'язуватися з тромбу-асоційованих активованих тромбоцитів і білків при гемодинамічної сдвиговом потоці 25-27. Таким чином, ми досліджували, чи можуть ці наночастинки могутсвязиваются з активно формують тромбів в артерії.

Як уже згадувалося в експерименті для ТАП перфузії, катетер був вставлений в яремну вену і з'єднаний з ін'єкційної насос для закачування наночастинку при рівномірному витраті. У цьому експеримент не флуоресценції барвника впорскують в миша, щоб маркувати тромбоцити. Замість того, щоб наночастинки були помічені Rohdamine В; тому вони були в змозі спостерігати під мікроскопом прижиттєвої. Тромбоз ініціювали 7,5% FeCl 3 обробки протягом 1 хв, як уже згадувалося раніше. Так як в WT мишей, значна кількість тромбів було виявлено, утворюють через 5 хв після травми, ми вибрали цей момент часу для введення наночастинок, щоб виявити, якщо наночастинки ефективно зв'язуються з активно утворюють тромби. Як показано на малюнку 5D і онлайн - відео 4, після введення флуоресцентних наночастинок, ми змогли визначити форму гірничо-тромб, який був поступово покривається флуоресцентних частинок. Ці дослідження демонструють корисність індукованої моделі тромбоз FeCl 3, щоб оцінити здатність цілепокладання (і подальшої терапевтичної ефективності) зернистих систем доставки лікарських засобів згустку-мішенню.

Роль червоних, відмінних від тромбоцити тромб формування клітин крові.
Недавні дослідження показали, що червоні клітини крові (еритроцитів) відіграють важливу роль в FeCl 3 моделі індукованої тромбоз 28, і вони є першим прихильником компонент крові до пошкодженої стінки судини 29,30. Щоб дослідити це явище, ми позначили RBCs з 1,1'-діоктадеціл-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine хлорнокіслий (разб, 10 мкМ кінцева концентрація). DIL-мічені Еритроцити промивали два рази ЗФР і ресуспендіровалі в сольовому розчині з 35% гематокриту. Діл-мічених RBC суспензію (100 мкл на миша) ін'екціонниее вид в тромбоцитопенической мишей, які були опромінених летальною дозою 5 днів до початку експерименту 19. Ці миші мають до тромбоцитопенії значного скорочення тромбоцитів, що збільшить шанси на РБК вичікувати до стінки судини, якщо вони роблять. На відміну від експериментів з використанням флуоресцентно-міченого тромбоцити (рисунок 5), не очевидно, накопичення флуоресціюючих клітин виявлено не було на стінці судини після пошкодження судин (6А, онлайн v 5) ідейно. Проте, поряд з утворенням збагаченої тромбоцитами тромбів, Еритроцити почав накопичуватися в тромб, який ілюструє форму згустку (фіг.6). Иммунофлуоресценции фарбування пошкодженої сонної артерії показав, що основні клітини, які прилипли до стінки судини тромбоцити (CD41 позитивний, зелений), в той час як Гомотетия мічені еритроцити, в основному, в пастці всередині тромбу (Фіг.6В & C). Ці дослідження показують, чтоFeCl 3 индуцированную модель Тромбоз може бути використана в отриманні механістичного уявлення про клітинних і молекулярних компонентів і просторово-часових подій в освіті тромбу.

Mesenteric Тромбоз Модель
Для мезентериального тромбозу на експериментальній моделі, висока концентрація FeCl 3 (10 - 12,5%) рекомендується як судини зазвичай оточені жировою тканиною, яка може перешкоджати дифузії FeCl 3 в напрямку стінки судини і, таким чином, запобігає судно від FeCl 3 індукованого травми 7 . Ця модель більше підходить для венозного дослідження тромбоз. Як показано в онлайн - відео 6, тромб був помічений близько ~ 15 сек в брижових вени після місцевого застосування фільтрувального паперу, насичений 12,5% 3 розчину FeCl, але утворення тромбу різко затримується в брижових артерії. Середній час на окклюзионная утворенню тромбів становить ~ 17 ± 7,2 хв (п = 11) в м esenteric вени і близько 23 ± 9,9 хв (п = 10) в брижових артерії при 12,5% FeCl 3 використовується 7.

Малюнок 1. Хірургія Інструменти. Мінімальні необхідні інструменти для хірургії миші показані. Дивіться список матеріалів для отримання більш докладної інформації. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 2. Миша Фіксування для хірургії. Закріпіть миша на 15 см культури блюдо кришкою для сонної артерії моделі тромбоз або для ін'єкції родаміну 6G барвника для брижової моделі тромбоз.получіть = "_blank"> Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 3. сонна артерія Тромбоз моделі. Процедури піддавати яремну вену, ін'єкції родаміну 6G флуоресцентний барвник в кровоносну систему і експозиції лівої сонної артерії показані. У формулі (А), лінія вказує надріз від рукоятки до рівня під'язикової кістки; в (Б), сині стрілки позначають підщелепної залози, і жовті пунктирні лінії представляють фасції між підщелепної залоз; в (С), сині стрілки вказують на підщелепної залози, чорна стрілка вказує на рукоятки, і пунктирна жовта лінія вказує на положення, щоб скоротити, щоб виставити яремну вену; в (D), синя стрілка вказує на яремну вену; в (Е), жовта стрілка вказує на лівий підщелепної, синя стрілка indicatес залишив кивательной м'язи, пунктирна жовта лінія вказує на лицьову панель, і зелена стрілка вказує на лопатно-під'язикова м'яз або грудинно-під'язиковий м'яз; в (F), синя стрілка вказує на сонній артерії, жовті пунктирні лінії показують тонкі грудино-під'язикова м'яз і / або для лопатки під'язикова м'яз; в (G), синя стрілка вказує на сонній артерії і зелена стрілка вказує на блукаючий нерв; в (H), синя стрілка вказує на сонній артерії і зелена стрілка вказує на пластикову "U-образне" кава мішалку; і в формулі (I), синя стрілка вказує на фільтрувальну папір, розташовану з 3 розчином FeCl, а зелена стрілка вказує на сонній артерії. T вказує на трахею. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 4. брижова артерія і вена Тромбоз моделі. Опромінення судин брижі, а також FeCl 3 лікування показано. В (А), синя стрілка вказує на білої лінії, Біла волокниста тканина без судна; В (Б), розсічення вирізати поодинці Linea альба було показано; в (С), сині стрілки вказують на другу дугу брижових артерій і вен; в (D), синя стрілка вказує на фільтрувальну папір, розташовану з FeCl 3 розчином. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 5. Представник Експерименти з використанням сонної артерії Тромбоз моделі. (А). Утворення тромбів в theC57Bl / 6 мишей обробляли 70,5% FeCl 3. (В). ТАП опосередкованої тромболітичної ефекту. (С). Ін'єкція антитіло, що впливає на рецептор миші тромбін PAR4 на був показаний тромбоз. (D). Тромбом-орієнтовані на сайти nanovehicles специфічно зв'язуються з активно утворюючи тромби було показано, Inj. P вказує на ін'єкцію частки; і пік В вказує на пік смугастості частинок до тромбів. Всі зображення були взяті під тим же збільшенням. Шкала бар = 300 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 6. Роль RBC на тромб формації. (А) тромбоцитопенічна мишей, які отримували перфузію Гомотетия мічених еритроцитах були піддані сонну артерію моделі тромбозі і зображень після того, як 7,5% FeCl (B & C) Травмовані сонні артерії збирали і готували заморожені зрізи. Тромбоцити фарбували CD41 (зелений) і еритроцитах були показані в вигляді червоного (разб). Ядра фарбували DAPI. Судини, показані у формулі (В і С) були з двох різних мишей. Шкала барів = 50 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Відео 1: Представник відео сонної артерії тромбоз моделі дикого типу (WT) мишей. (Клацніть правою кнопкою миші , щоб завантажити.) Це відео показує формування репрезентативної тромбу в сонної артерії мишей WT індукованого місцевого нанесення фільтрувальну папір, расположеннуюс 7,5% FeCl 3 розчину. Тромбоцити були помічені шляхом внутрішньовенної ін'єкції родаміну 6G, і відео було розміщено в монохромному режимі. Біла маса запеклася тромбоцити.

Відео 2: тканинний активатор плазміногену (ТАП) , опосередковані тромболітична ефект виявлений з допомогою моделі тромбоз сонної артерії. (Клацніть правою кнопкою миші , щоб завантажити.) Тромбоцити маркування та утворення тромбу було розпочато як згадано в відео 1 і ТАП вводили внутрішньовенно через 5 хв після 7,5% FeCl 3 травми.

Відео 3: Антитромбоцитарна наркотиків, на Mely анти-протеази активоване рецептор 4 (PAR4) антитіло, опосередкована антитромботичний ефект виявлений за допомогою моделі тромбоз сонної артерії. (Клацніть правою кнопкою миші, щоб завантажити.) В цьому експерименті миші отримували Par4 антитіла і родаміну 6G ін'єкції за 10 хв до утворення тромбу було ініційовано місцевого нанесення фільтрувальну папір, розташовану з 7,5% FeCl 3.

Відео 4: Наночастки опосередкованої тромби конкретним націлювання. (Клацніть правою кнопкою миші , щоб завантажити.) В цьому експерименті, утворення тромбу сонної артерії була розпочата з 7,5% FeCl 3 без маркування тромбоцитів. Наночастки мітили родаміну В і вводять внутрішньовенно в миша 5 хв після травми.

Відео 5 "SRC =" / файли / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Відео 5: Зв'язування червоних кров'яних клітин , виявлених з допомогою моделі тромбоз сонної артерії. (Клацніть правою кнопкою миші , щоб завантажити.) Еритроцити (RBCs) були помічені 1,1'-діоктадеціл-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine перхлората (Діль, 10 мкМ кінцева концентрація), і 100 мкл Гомотетия мічені еритроцити (35% гематокриту) вводили в тромбоцитопенической мишей. Немає маркування тромбоцитів не проводилося в цьому експерименті. Тромб був ініційований як згадувалося вище with7.5% FeCl 3.

Відео 6: Представник відео брижової артерії та вени моделі тромбозу на мишах WT. (Правою кнопкою клі ск для завантаження.) Тромбоцити мітили шляхом внутрішньовенної ін'єкції родаміну 6G, а тромб був ініційований місцево після застосування одного шматка фільтрувального паперу з 12,5% розчином FeCl 3 протягом 1 хв. Судно спостерігалося при 10-кратному сухий лінзи.