Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Схема представлена на малюнку 1 ілюструє загальний робочий LCM Атлас керуватися конкретними мозку і потенційних течією аналіз додатків. Це дослідження зосереджено на чотирьох областях мозку, ставлення до TBI патофізіології та розвитку супутніх захворювань: ОЛР, AcbC, СКС і Hp. Обмеження в LCM конкретних мозку є, що анатомічних місцях часто ховається відсутність певних меж, як можна побачити в малюнку 2 (A, D, G, J). Використання мозку Атлас секціонування і лазерні захоплення конкретних регіонів зменшує ймовірність забруднення зразка з регіонів мозку, крім мети. Коли обережність слідувати тканини пам'ятки, як при різанні, так і після фарбування Нісль, LCM технологія може забезпечити досить послідовною засобом придбання окремих популяцій клітин, ядер або регіонам15. Довгострокові цілі цих досліджень є для ідентифікації генів і мікроРНК, який потенційно може служити в якості сурогату, неінвазивна біомаркерів конкретних забиття мозку регіоні. Перший крок в цей трубопровід біомаркерів розвитку є характеристика тканин специфічних transcriptional змін після експериментальної TBI. Ці дані потім можуть бути пов'язані з травми індуковані зміни в поширенні biofluids.

Представлені процедури були оптимізовані для пом'якшення ризику деградації РНК для того, щоб дозволити РНК аналізу через зворотна транскрипція всього LCM РНК до кількісної ПЛР в реальному часі (RT-ПЦР). Загальна РНК (в тому числі дрібних і великих видів РНК) був ізольований за допомогою методу ізоляції на основі стовпця на тканини, який був захоплений лазера від індивідуальних мозку. Для оцінки цілісності РНК, якості і кількості після процедури ізоляції, РНК зразки були коротко денатурований при 70 ° C і запустити на РНК аналізатора. Якісні вимірювання включають аналіз пік амплітуд 18s і 28s рРНК смуг () Малюнок 3), який може бути представник загальної деградації і за допомогою «РНК цілісності номер» (Рин). Якщо за допомогою ретельного безкоштовно РНКази техніки, РНК ізольовані від LCM зразків зазвичай результати в промивання, які варіюються від 6-8. Нижня Рін може означати низька якість РНК і потенційно може зменшити точність аналізу виразу гена і мікроРНК. І навпаки вище RIN можна поліпшити впевненість в достовірності результатів, створені з РНК аналізу.

RT-ПЛР була виконана з використанням наборів праймер / зонд для окремих генів і мікроРНК (рис. 4). Приблизно 1 нг всього РНК була зворотної транскрипції в cDNA і попередньо посилений перед ПЛР була виконана згідно з протоколом від виробника. Травми пов'язаних генів, оцінені в цьому дослідженні були X пов'язаний BCL2, регулятор апоптозу (Bax), B-клітинної лімфоми / CLL 2 (Bcl-2), Caspase-3, пептідаза хвоща Apoptosis-Related (Casp3), Мозок похідні нейротрофічних факторів ( Bdnf) і табір реагувати елемент прив'язки протеїн 1 (Creb). Світ 15b був обраний тому, що було показано, бути змінені після експериментальної TBI в вмираючого індивідуальних нейронів. Він також експериментально перевірений і bioinformatically передбачив мети гена з функціями про виживання (неопубліковані дані). Нормалізоване фолд зміни співвідношення були розраховані методом ΔΔCt, порівняння рівнів вираження гена і мікроРНК в TBI тварин і наївно контроль, з нормалізацією ендогенного гена (Gapdh) або малі РНК (U6), відповідно. Фолд зміни вище 1 вказує загальну upregulation в цьому ген або мікроРНК, і навпаки, раз менше, ніж 1 вказує даунрегуляції змінити. Статистичний аналіз показав значні зміни в експресії генів між ЧМТ і наївно управління (p ≤ 0,05), залежать від області мозку. Ніяких істотних змін в вираженні світ 15b були виявлені між управління ЧМТ і наївно, але там були тенденції до вище і нижче вираз в мозок регіону залежить від моди. Ці дані вказують на те, що подальша оптимізація необхідно оцінити зміни в вираженні мікроРНК. Це також можливо, розмір вибірки був занадто малий, щоб отримати статистичної значущості, почасти через властивих мінливості в вираженні. Майбутні дослідження буде включати в себе Шам експлуатованих тварин, щоб забезпечити цей ген і мікроРНК вираз зміни пов'язані з ЧМТ і не через хірургічної підготовки.

Малюнок 1. Робочий процес Атлас керуючись LCM течією геномного аналізу. (AF) Процедури з тварин підготовки до течії ПЛР аналіз: (A) дорослих, чоловічий Sprague-Dawley щурів (~ 6 тижнів віку і вагою 300 г) під наркозом, піддаються рідини перкусія TBI і гуманно euthanized 24 год після травми. (B) послідовних секцій (30 мкм) свіжі заморожених мізків засновані на координати регіонів конкретних мозку (ОЛР, AcbC, Hp, SCN) від Paxinos і Уотсон Атлас мозку щура. (C) секції фіксованою, забарвлених Нісль (1% кількість кресах фіолетовий), зневоднена і повітряна сушка. (D). LCM здійснюється на певних областях мозку з LCM системою. (E) LCM макрос шапки переноситься на вільних РНКази 0,5 мл трубки з 100 мкл буфера lysis клітини і зберігаються при температурі-80 ° до РНК ізоляції нижче за течією геномного аналізу. РНК можуть потім бути зворотної транскрипції гена або мікроРНК RT-ПЛР аналізу для вивчення диференціального прояв молекулярних орієнтація після ЧМТ і / або між регіонами мозку (F). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2. LCM TBI постраждалих регіонах мозку. Представник образи розділів тканини зібраних з боку іпсилатеральний травми сайту з ІК і УФ лазерного функцій в системі LCM (A-я). Тканина була секційного на кріостату (30 мкм) і зібрані на перо мембрани слайди. Розділи потім фіксували, забарвлених Нісль з кількість кресах фіолетовий (1%) і збезводненої для виявлення конкретних мозку регіонів на основі анатомічних орієнтирів, посилання в Paxinos і Уотсон Атлас мозку щура. (AC) Площа фронтальної асоціативної кори (FrA) (DF) компоненти СА1, CA2 і CA3 пірамідних шарів гіпокампу (Hp) розташований поруч з повністю сформовані роги шарі гранул зубчастої звивини (GrDG). (GI) Площа nucleus accumbens coRe (AcbC) проксимальний і Ростральні передньої спайки (aca). (JK) Супрахіазмальное ядро (SCN) ростральної supraoptic нервів (оч). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3. Представник перевірок якості РНК. Представник electropherograms і зображень пов'язаних гель РНК, похідний від LCM зібрані тканини (AD). Electropherograms і пов'язаних гель зображення показують недоторканими РНК, заснований на появу 18s і 28s рРНК піків і гель смуг. Ця РНК підходить для всіх хто сходить додатки, в тому числі геномна і протеомних аналізів. (A) фронтальної асоціативної кори (FrA) РНК. РИН 6.1. (B) гіпокампу (Hp) РНК. РИН 4.4. (C) прилежащем основних РНК (AcbC). РИН 7.3. (D) Супрахіазмальное ядро (SCN) РНК. РИН 7,6. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4. Вниз за течією аналіз мозку конкретного регіону гена і мікроРНК вираз через RT-ПЛР. Індивідуальні RT-ПЛР для генів інтерес (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) і мікроРНК інтерес (світ 15b) була виконана на лазерної захопили регіонах мозку після ЧМТ (Hp і AcbC n = 5, ОЛР n = 4) і в порівнянні з поранений наївно тварин (n = 4). Був проведений аналіз генів, пов'язаних з TBI патогенезу для Hp, AcbC, FCx. дані представлені в вигляді нормалізованого раз зміни співвідношення в порівнянні з наївними управління мозку регіонів (неспарених t-тест з Уелча корекції ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Диференціальний вираз світ 15b в різних мозку представлена як нормалізоване раз зміни в порівнянні з наївними управління (± SEM) (B). Дані з SCN (n = 2) не включені. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.