Методика проведення електрофорезу в агарозному гелі

Електрофорез (від електро- і грец. Φορέω - «переношу») -метод поділу макромолекул, що розрізняються за розміром, молекулярної масі, просторовою конфігурацією, вторинної структурою або електричного заряду. Вперше було відкрито професорами Московського університету П. І. Страховим і Ф. Ф. Рейссом в 1809 році.

принцип методу

Молекули в буферному розчині мають електричним зарядом, величина і знак якого залежать від pH середовища. При пропущенні електричного струму через розчин в ньому формується спрямоване електричне поле, напруженість якого вимірюється різницею потенціалів на кінцях ємності, в якій проводиться електрофорез. Під дією поля молекули починають рух в напрямку катода або анода. Швидкість руху залежить від величини заряду, розмірів і тертя навколишнього середовища. З плином часу суміш розділяється на фракції, що складаються з молекул, що рухаються з однаковою швидкістю. В сучасних експериментах робочий канал приладів для електрофорезу заповнюють гелем, мають структуру сітки. У цьому випадку основний вплив на рухливість молекул і їх ступінь поділу надають їх лінійні розміри. У деяких випадках може виникнути ситуація, при якій особливо великі молекули не проходять через пори гелю.

Методика електрофорезу в агарозному гелі.

Електрофорез в агарозному гелі в різних модифікаціях широко застосовується для поділу молекул нуклеїнових кислот, білків і інших макромолекул в біології та медицині. На водяній бані або в лабораторній печі плавлять суміш агарози , Буфера і води. Потім її охолоджують до 50-60 ° C і заливають у форму. Лунки для нанесення робляться за допомогою гребінки. Досліджуваний зразок наносять в лунку за допомогою дозатора . Коли барвник, що поміщається в лунки на початку експерименту, досягає кінця гелю, електрофорез зупиняють. Потім гель забарвлюють барвником, який зв'язується з досліджуваними молекулами. Інтенсивність забарвлення смуг барвника дає уявлення про концентрацію молекул в зразку. Крім концентрації, метод електрофорезу дозволяє визначити відносну молекулярну масу досліджуваних молекул, для цього в крайню лунку поміщають набір маркерів молекулярної маси , Який повинен повністю покривати діапазон молекулярних мас досліджуваної системи.

Вибір карсітеля і буфера

бромфеноловий синій і ксіленціанол - можуть помітно заважати спостереженню фрагментів під UV. Барвник Cresol red сумісний з ферментативними реакціями, практично не заважає спостереженню під UV. OrangeG найбільш рухливий барвник, практично завжди знаходиться поза "робочої зони". Помітний під UV. Барвник в буфері потрібен лише для того, щоб зразок був легко помітний в лунці і в гелі.

Саме широке застосування агарозній гелі мають в дослідженнях, пов'язані з поділом нуклінових кислот. Останні мають досить значні негативний заряд, величина якого слабо завісіот від pH розчину, внаслідок чого поділ на фракції відбувається в основному за рахунок різниці в лінійних розмірів молекул. У таких експериментах використовують 0.089М Тріс-боратний, 0.05 Трсфосфатний і Тріс-ацетатний буфер. Варто відзначити, що при звичайному електрофорезі в гелі можна розділяти фрагменти нуклеїнових кислот, розмір яких менше 50 тис пар основ Також часто з експерименту потрібно отримати оцінку розмірів молекул. Для цього використовуються набори молекул зазвичай задовгі. Наприклад, для реєстрації продуктів ампліфікації ДНК застосовується електрофорез в агарозному гелі в присутності бромистого еітідія, який утворює з фрагментами ДНК стійке з'єднання впровадження, що виявляється у вигляді світних смуг при опроміненні гелю УФ-випромінюванням довжиною хвилі 290-330 нм.