трансгенні тварини

Успіхи генетики, молекулярної біології та інших біологічних наук дали вченим можливість працювати з ізольованими генами вищих організмів. Можна виділяти гени, з'ясовувати деякі механізми їх роботи і конструювати нові, гібридні гени, яких не існує в природі. Такі гени можна вводити в клітини бактерій і вищих організмів, і вони здатні вбудовуватися в спадковий апарат клітин. А далі можна отримати тварин, що містять в кожній клітині чужорідні гени. В кінці 70-х і початку 80-х років в деяких лабораторіях світу і Радянського Союзу були розпочаті роботи по введенню чужорідних генів в запліднені яйцеклітини миші як найбільш доступного і генетично вивченого об'єкта. Тварини, що містять чужорідні гени, отримали назву трансгенних. В даний час вже є деякі успіхи в отриманні трансгенних мишей і їх використанні для вирішення тих чи інших біологічних задач. Про ці роботи розповідають наукові співробітники Л. С. Попов (Інститут молекулярної генетики АН СРСР) і Л. Г Ешкінд (ВНІІбіотехнологіі), що ведуть дослідження в цій області.

Нормальна і карликова миші.

Нормальна миша поруч з трансгенної мишею, в геном якої ввели гормон росту.

Схема отримання трансгенних мишей. В ізольовану хірургічним шляхом вже запліднену яйцеклітину вводяться гени. Цю клітку підсаджують ложнобеременной, тобто попередньо спареної із стерильним самцем, самці. Вона стає прийомною матір'ю. З виведених штучно яйцеклітин народжується потомство. Оскільки не всі мишенята отримують чужорідний ген, необхідний молекулярний аналіз їх генома для справжнього виявлення трансгенів.

Дія трансгени. Можливі поєднання статевих клітин (яйцеклітин і сперматозоїдів) при заплідненні призводять до утворення чотирьох типів зигот. Перший тип - коли в зиготі трансгени розташовується в альфа-1-коллагеновом гені хромосом, отриманих від матері і від батька. В цьому випадку ембріон нежиттєздатний. У другому і третьому типах трансгени знаходиться в альфа-1-коллагеновом гені хромосом тільки матері або тільки батька. У четвертому типі хромосоми не містять трансгени. В останніх трьох випадках ембріони життєздатні.

<

>

На початку 80-х років група вчених США та Швеції вперше отримала мишей-велетнів. Це був результат введення гена гормону росту пацюка в запліднені яйцеклітини миші. І виросла з цього зародка миша-велетень виявилася майже в два рази більше звичайної. Але головний результат досвіду полягав в тому, що трансгенна миша росла в два рази швидше, ніж звичайна.

Ви можете запитати: навіщо нам прискорювати зростання мишей? Ось якби кури або корови росли в короткий термін, то це було б більш корисним для людей.

Дійсно, непогано було б навчитися розводити в скорочений термін корисних для людини птахів і тварин. І ця можливість тепер в перспективі є. Більш того, вже є і перші успіхи в отриманні трансгенних тварин - таких, як корова, вівця і свиня, хоча ці роботи поки дуже дороги.

Яким же чином вдалося вченим прискорити зростання мишей? Одним з основних стимуляторів росту і ділення клітин у тварин і людини є гормон росту. Утворюється він зазвичай в гіпофізі. Вчені вирішили перевірити, як буде вести себе чужорідний гормон росту в організмі миші. Структурний ген цього гормону ввели в яйцеклітину. Отримали потомство, і виявилося, що гормон щури вироблявся в серці, нирках, печінці і кишечнику, але не в гіпофізі. При цьому кількість гормону в крові підвищувався в декілька сотень разів в порівнянні з нормальними мишами. Очевидно, тому деякі миші і виростали велетнями.

Такі ж маніпуляції були пророблені з більш віддаленим родичем - геном гормону росту людини. Миші і в цьому випадку росли прискорено. Більш того, виявився дивовижний факт: незважаючи на те, що гормон росту людини містить майже в три рази більше амінокислот, ніж гормон росту пацюка, це не впливало на посилений ріст мишей - обидва гормону діяли з однаковою силою.

Звичайно, тут ще багато складнощів: як звичайно, відповіді на перші запитання ставлять нові питання, і відповіді на них поки немає. Але хочеться звернути увагу читачів на те, що в крові трансгенних мишей різко збільшується кількість гормону росту. Це відкриває можливість використовувати трансгенних тварин в якості біологічної фабрики гормону росту людини, тобто з'являється вихід в біотехнологію, здатну конкурувати зі звичайною мікробіологічної фабрикою. При цьому треба пам'ятати, що миша - всього лише об'єкт дослідження, а сировиною для біологічної фабрики може служити кров більших трансгенних тварин (вівці, свині, кролика та ін.).

Однією з головних проблем біології, рішення якої, мабуть, не обійдеться без використання трансгенних тварин, є проблема диференціювання клітин. У зародку організму всі клітини спочатку однакові, але в ході розвитку вони стають клітинами м'язів, кісток, нервів, серця, печінки та інших органів і тканин. Іншими словами, в ході розвитку організму клітини отримують спеціальність. Але як саме це відбувається, науці поки невідомо. Проблема тим часом величезна і надзвичайно важлива, тому що мова йде про те, щоб зрозуміти суть ембріонального розвитку, коли з однієї клітини розвивається настільки складний організм, як тіло ссавців і особливо людини.

Ще на початку нашого століття ембріологи експериментатори намагалися з'ясувати це за допомогою мікроманіпуляцій, руйнуючи деякі ембріональні клітини гінкими голками або пересаджуючи ділянки тканини від одного раннього ембріона іншому. Подібні методи зберегли своє значення і понині при вивченні просторової організації клітин, що обумовлює виникнення окремих органів або тканин. Однак ці методи, як і звичайні біохімічні методи з використанням очищених молекул в пробірці, не дозволяють зробити прямих висновків щодо молекулярних основ регуляції роботи генів,

Для вирішення проблеми диференціювання вчені часто використовують культури клітин і тканин. Але відповідь на питання, які молекулярні механізми змушують клітини диференціюватися, і на цій моделі ми отримали. Її недолік полягає в тому, що культивовані клітини ізольовані від організму. У них немає контакту з клітинами інших тканин, а такий контакт (взаємодія клітин, обмін сигналами) необхідний, бо він індукує диференціювання і ембріональний розвиток. Висновок напрошується сам: вивчати молекулярні механізми диференціювання клітин і раннього ембріонального розвитку треба на живому організмі. Саме тому великі надії покладаються на живі моделі - трансгенних тварин.

Але як цю модель використовувати? Нагадаємо, що для отримання трансгенних тварин потрібні гени. Однак для конкретної мети потрібні, очевидно, відповідні їй гени. Які ж з них пов'язані з диференціюванням?

В останні роки вченим вдалося виявити деякі гени-регулятори, які беруть участь в реалізації програми розвитку організму. Їх називають хроногенамі, так як, на думку вчених, вони грають основну роль у визначенні моменту початку диференційований клітин даного організму.

Найбільш цікаві спостереження були отримані при вивченні генів, що контролюють просторову організацію ембріона плодової мушки дрозофіли. Виявилося, що багато генів містять один і той же сегмент ДНК, названий гомеобокс, і всі вони мають здатність регулювати активність груп інших генів. Зауважимо, що в даний час гомеобокс виділений з ДНК багатьох організмів - від черв'яків до людини.

Не можна промовчати про онкогенах, які виявлені в нормальних клітинах більшості організмів (від дріжджів до ссавців). Вчені припускають, що онкогени не тільки породжують пухлини, а й беруть участь у диференціюванні ембріональних клітин. Підставою такого припущення послужили деякі факти. Так, наприклад, було з'ясовано, що для підтримки зростання і ділення клітин раннього ембріона необхідні фактори росту. Але у раннього ембріона ще немає тканин, здатних виробляти ці чинники, тому можна думати, що кожна клітина раннього ембріона виробляє їх для самої себе і, можливо, для свого найближчого оточення. Фактори зростання є білки, що кодують генами. Нещодавно стало відомо, що один з чинників зростання кодує онкоген СІС. Звідси напрошується висновок, що онкогени беруть участь в ранньому розвитку ембріона (більш докладно ця проблема викладена в статті В. Дільмана, «Наука і життя» №11, 1985).

Отже, вчені мають зараз у своєму «господарстві» ряд чудових послідовностей ДНК у вигляді хроногенов, сегмента гомеобокс і онкогенов, які причетні до диференціювання клітин в ембріональному розвитку. Їх можна вводити в геном майбутніх трансгенних тварин і вивчати їх дію під час зростання ранніх ембріонів. Мабуть, це дає ключ, який дозволить проникнути в таємниці молекулярних механізмів розвитку вищих тварин.

Крім того, введення ізольованого онкогена в геном здорової тварини дає і іншу можливість - вивчати окремо стадії утворення пухлин і спадкову схильність до їх виникнення. Іншими словами, створювати моделі течії пухлинних захворювань. Адже механізм їх утворення - процес дуже складний, багатоступінчастий і включає багато подій в клітині і організмі. Зрозуміло, що для того щоб розібратися в ньому, потрібно виокремити окремі його щаблі. Багатьох ступенів ми ще не знаємо. Жива модель - трансгенні тварини відкривають тут небувалі перспективи. Пошук механізмів утворення пухлин вже ведеться і вселяє надії на успіх.

Створення експериментальних моделей перебігу хвороб відкриває нові напрямки і перед практичною медициною, зокрема лікуванням спадкових захворювань. В даний час налічується близько трьох тисяч спадкових захворювань. Деякі з них можуть бути наслідком порушення складних регуляторних систем організму. Більшість же пов'язано з нестачею ферментів. Як приклад можна назвати фенілкетонурію, вроджену непереносимість лактози, подагру, гемолітична анемія та багато інших.

Терапія таких захворювань, здавалося б, проста - ввів в організм відсутній фермент і чекай поліпшення. Однак діє фермент недовго, і доводиться робити хворому систематичні ін'єкції. Можна використовувати обмеження харчового раціону, щоб знизити в організмі концентрацію шкідливих речовин. Ці способи досить успішно використовуються, але справедливості заради слід сказати, що лікування рідко буває повним. Тому в порядок денний постало так звана генна терапії, тобто методи введення в хворі клітини відсутнього гена або заміни дефектного гена нормальним.

Справа ця виявилася непростою. Перш за все необхідно мати нормальний ген. Зараз їх вже навчилися отримувати. Для доставки нормального гена в дефектні клітини потрібно «візок». У цій ролі вчені вирішили використовувати віруси. Хоча ця ідея не нова, вона до останніх кількох років залишалася нереалізованою. Найбільш придатними виявилися пухлинні віруси, геном яких складається з РНК (ретровіруси). Ці віруси відрізняються тим, що не вбивають клітини подібно до інших вірусів. За допомогою генної інженерії потрібно було перетворити вихідний вірус в вірус-візок, функція якого полягала б лише в доставці потрібного гена в клітину і встановленні його в клітинні хромосоми. Молекулярні біологи з Массачусетського технологічного інституту (США) сконструювали такий вірус. Потім «навантажили» його бактеріальним геном стійкості до антибіотика і ввели цю навантажену візок в кровотворні клітини кісткового мозку миші. Аналіз показав, що всі типи клітин крові експериментальної миші придбали цей перенесений бактеріальний ген.

Теоретично цей метод вже можна застосувати до генотерапіі спадкових захворювань крові людей. Однак технічні проблеми, пов'язані з регулюванням роботи перенесених генів, не дозволяють поки це робити. Дослідження тривають.

Інший спосіб генотерапіі пов'язаний зі статевими клітинами. Група дослідників використовувала його зовсім недавно. Як об'єкт вони взяли карликову миша, яка може служити моделлю спадкового захворювання людини. У такий миші відставання в рості помітно з п'ятиденного віку, а дорослі тварини досягають приблизно половини нормальної миші. Оскільки введення гена гормону росту відновлювало зростання, то вчені вирішили виправити карликовість за допомогою генної терапії. Спочатку вони вводили в яйцеклітину карликової миші чисті гени гормону росту пацюка або людини. Зростання не відновлювався. Коли ж вони ввели в яйцеклітину додатково ген-регулятор, то карликова миша виростала до нормальної. Здавалося б, такий успіх можна перенести на лікування подібного захворювання у людей. Але доведеться розчарувати читачів: робити цього поки не можна. Причин кілька. Одна з них пов'язана з низькою ефективністю техніки гемотерапіі. По-перше, тільки один відсоток яйцеклітин з введенням чужим геном розвивається в миша, у якої посилено дію гормону росту. По-друге, поки практично неможливо передбачити, в яке місце вбудується чужорідна молекула ДНК, і тому-то неможливо гарантовано замінити пошкоджений ген нормальним. Більш того, вводиться ген може потрапити «не туди» і зруйнувати який-небудь нормальний ген, тобто дасть результат, зворотний бажаному.

Таким чином, ці приклади показують, що використовувати запропоновані способи для лікування хворих людей ще неможливо. Щоб втручатися в спадковість людини, принаймні необхідно знати повністю генотип людини. Наука поки далека від цього. Однак перші успіхи на цьому шляху, хоча і дуже малі, надихають учених на подальші пошуки.

Нарешті, ще одна область можливого використання трансгенних тварин - це підвищення кількості та якості продукції сільськогосподарських тварин. Так, сам по собі прискорене зростання трансгенних тварин, мабуть, дозволяє збільшити вихід м'яса. Але, крім того, є ж і можливість (поки теоретична, звичайно) ввести, скажімо, в корову ген необхідного продукту і змусити його працювати в молочних залозах, а продукти гена виділяти потім з молока. Згодом люди навчаться отримувати таким чином лікарські препарати - інтерферон, інсулін, гормон росту та інші потрібні речовини. Словом, сільськогосподарські тварини зможуть нести ті чи інші конструкції генів і перетворяться в живі фабрики біологічно і хімічно важливих пептидів і білків.

Все це звучить зараз занадто фантастично, проте фантазія нерідко переходить в реальність. І хто знає, може бути, для людей майбутнього стануть звичайними назви спеціалізованих господарств - наприклад, радгосп «цукрових» корів, тобто трансгенних корів, молоко яких містить велику кількість цукру.

З іншого боку, техніка отримання трансгенних тварин, мабуть, може допомогти швидше переносити корисні властивості однієї породи до іншої, тобто прискорити виведення нових високопродуктивних порід тварин. Це відкриє небачені обрії перед сільськогосподарської генетикою і селекцією.

Як бачимо, можна констатувати, що біологія вступила в період реального втілення заповітної мрії человечества- спрямованого зміни вищих організмів. Не за горами майбутнє - конструювання геномів тварин і рослин.

Однак тут зазвичай виникає дуже серйозне питання, яке цікавить, до речі, багатьох наших читачів: чи не небезпечні генно-інженерні маніпуляції з ДНК для людини, тварин і рослин? Адже в результаті таких маніпуляцій можуть з'явитися організми з абсолютно новими генетичними якостями, які раніше не існували на Землі. І якщо вони вийдуть якимось чином з-під контролю, поширяться в природі, то це може викликати небажані зміни в генетичному апараті земних організмів - вроджені вади, каліцтва і т. П.

Тому ще на зорі генної інженерії, в середині 70-х років, група дослідників звернулася до вчених усього світу із закликом накласти мораторій на генетичні експерименти в найбільш небезпечних для людини напрямках досліджень. А потім, в лютому 1975 року народження, в США була скликана міжнародна конференція, на якій були присутні 140 вчених з 17 країн, в тому числі і з Радянського Союзу. Роботі цієї конференції стала першим в історії світової науки прикладом прийняття запобіжних заходів до, а не після того, як виникла небезпека: на ній була оголошена заборона ні проведення особливо небезпечних експериментів до розробки відповідних запобіжних заходів.

После конференции дослідження з генної інженерії були кілька переорієнтовані. Як об'єкти для генетичних маніпуляцій були взяті тільки ті мікроорганізми, які не здатні населяти кишковий тракт людини, не виживають в статевих клітинах і легко знищуються звичайними миючими засобами.

Потім в нашій країні (так само, як і в інших країнах) були прийняті правила безпеки робіт з рекомбінантними (складовими) молекулами ДНК. У нас ці правила узгоджені з Міністерством охорони здоров'я СРСР і ВЦРПС і є обов'язковими для всіх, хто має справу з генною інженерією.

У чому ж полягають ці правила? Вони, зокрема, включають деякі загальні вимоги безпеки: роботу необхідно проводити в спеціальному одязі і спеціальними інструментами, які не дозволяється курити, зберігати і приймати їжу в робочих приміщеннях, відходи, що містять рекомбінантні молекули, поміщаються в спеціальний посуд і знезаражуються і т. Д.

Крім того, вживаються заходи фізичної і біологічного захисту різних ступенів - в залежності від величини передбачуваної небезпеки експерименту. Так, середній рівень фізичного захисту (ФЗ) вимагає проводити експерименти в лабораторії, що має спеціальні інженерні конструкції, герметичне приміщення і захисне обладнання. Повітря з лабораторії виводиться з самостійною Повітродуви після очищення на фільтрах. Робота з відкритими судинами, в яких міститься матеріал з носієм рекомбінантних ДНК, обов'язково проводиться в боксах зі зниженим тиском. Лабораторну одяг можна носити поза лабораторією ФЗ, вона повинна знезаражуватися до відправки в пральню. Перед виходом з лабораторії персонал зобов'язаний мити руки з використанням дезінфікуючих засобів і т. Д.

Вищий рівень фізичної Захисту (Ф4) застосовується до робіт з мікроорганізмами, потенційно небезпечними для людини, тварин і рослин. Експерименти можуть проводитися тільки в приміщеннях особливої ​​конструкції - в окремій будівлі або в повністю ізольованому від інших приміщень відсіку загального будівлі. Інженерні особливості такої лабораторії: монолітні стіни, підлоги і стелі, в яких всі технічні отвори (для повітряних каналів, електропроводки, трубопровідних комунікацій) герметизуються. Лабораторія повинна мати окрему вентиляційну систему, яка підтримує негативний тиск повітря до виходу його в атмосферу, повітряні шлюзи, через які можуть безпечно доставлятися в приміщення предмети обладнання, посуд, тварини та матеріали. Вхід в лабораторію дозволяється тільки тим особам, чия присутність передбачено програмою дослідження. Роботи повинні виконуватися в боксах з витяжною вентиляцією і фільтрами. Доступ в ці бокси можливий лише з робочих приміщень лабораторії.

Важливим елементом правил є біологічні заходи захисту, що дозволяють використовувати тільки такі мікроорганізми, біологічні властивості яких виключають їх поширення і виживання в навколишньому середовищі. Зокрема, категорично забороняється використовувати для отримання рекомбінантних молекул ДНК бактерії і віруси, патогенні для людини, сільськогосподарських тварин і рослин. Тим більше не дозволяється навмисне введення в рекомбінантні молекули генів, свідомо небезпечних для здоров'я і благополуччя людини, і навмисне поширення нових рекомбінантних молекул в навколишньому середовищі. (Тут перераховано, зрозуміло, тільки частина захисних заходів. При бажанні з ними можна детальніше познайомитися в книзі «Підсумки науки і техніки. Молекулярна біологія», том 12, частина II, Москва, 1980 г., стр. 199.)

Треба сказати, що з часом - у міру накопичення знань і розвитку техніки генної інженерії - потенційна небезпека подібних експериментів виявилася перебільшеною, і зараз правила роботи з рекомбінантними молекулами переглядаються з метою зняття деяких обмежень. Це дозволить розширити можливості досліджень - при колишньому, максимальному рівні езопасності.