Трильйонів беззвучно ГОДИН

Наука і життя // Ілюстрації

Земля. Занурення в сон. (Комп'ютерне зображення з сайту www.nasa.gov.)

Французький астроном Жан-Жак де Меран (1678-1771) став родоначальником науки про добових ритмах.

Цікаво, що не всі істоти на Землі підкоряються сонячного циклу.

Добовий ритм рослин цікавив і Чарльза Дарвіна. Він винайшов апарат для вимірювання руху листя.

Відомий американський нейрофізіолог Н. Клейтман проводить моніторинг сну свого асистента Б. Річардсона під час експериментальної самоізоляції в Мамонтової печері (штат Кентуккі, США). 1938 рік.

Діаграма добової активності (актограмма) людини за відсутності зовнішніх сигналів - цайтгеберов (період сну показаний суцільною лінією).

Добовим ритмом ссавців управляє скупчення нейронів - супрахіазматіческое ядро, що знаходиться в гіпоталамусі.

Рон Конопка (зліва) і Сеймур Бензер, що відкрили в 1971 році годинний ген періодичності Per, дають інтерв'ю в Каліфорнійському технологічному інституті. 2000 рік.

Локалізація гена Per на генетичній карті дрозофіли.

Хенрік Остер керує науковою групою, що вивчає циркадні ритми тварин, в Інституті біофізичної хімії Макса Планка (Німеччина).

Схема циклічної активації годинних генів Per і Cry в клітці.

Можна «помітити» годинниковою ген геном люциферази (ферменту з світлячків, що генерує біолюмінесценцію), а потім за допомогою біолюмінесцентного аналізу побачити циркадних пульсацію будь-якого органу і тканини.

Внутрішній годинник під впливом світлового сигналу, який супрахіазматіческое ядро ​​перетворює в сигнал гормональний, можуть переводитися «вперед» або «назад».

<

>

Все живе на Землі підпорядковується добовому ритму сну і неспання. Винятку не становлять навіть рослини. Листки подорожника днем ​​приймають горизонтальне положення, а вночі складаються на зразок парасольки. При повному сонячному освітленні квітки кульбаби стають жовтими і пухнастими, в темряві ж щільно замикають пелюстки. Довгий час вважалося, що добовий ритм життєдіяльності залежить тільки від зовнішніх факторів, а саме від освітленості.

У 1729 році французький астроном Жан-Жак де Меран зацікавився геліотроп (від грец. Helios - сонце, tropos - поворот) - рослинами сімейства бурачникових, які повертають суцвіття слідом за сонцем і опускають свої листя на ніч. На свій подив, де Меран виявив, що геліотропи продовжують піднімати і опускати листя в повній темряві. Але далі спостереження вчений не пішов, чи не зробивши жодних висновків зі свого досвіду.

Експерименти де Мepaнa продовжив тридцять років потому його співвітчизник ботанік Анрі-Луї Дюамель. Він помістив горщик з геліотропом в темний льох. Увечері і вранці вчений відвідував свого вихованця і заставав квітка або «сплячим», або «пильнують» з розгорнутими листочками. Більш того, вчений поставив квітка в темний скриня і для підтримки постійної температури щільно накрив його ковдрами. Але ніщо не допомогло - квітка продовжував дотримуватися режиму сну і неспання. Дюамель прийшов до сміливого висновку: «... рух листя рослин не залежить від світла і тепла». Тоді від чого ж?

Через сто років за справу взявся великий швейцарський ботанік Огюстен Бенкетам Декандоль. Вдень і вночі шість яскравих ліхтарів освітлювали мімозу, але та продовжувала складати листя на ніч і розправляти їх з ранку. Коли ж Декандоль став висвітлювати листя тільки ночами, мімоза перейшла на новий ритм - днем ​​спала, а вночі не спала. Потім, правда, вона повернулася до колишніх звичок.

Висновок однозначний: добовий ритм рослин є якесь внутрішнє властивість, властиве їм незалежно від світлового дня. Але пройшло ще довгий століття, поки не було доведено, що «внутрішній хронометр» є і у тварин, в тому числі у людини.

У 1938 році знаменитий американський нейрофізіолог Натаніель Клейтман і студент Чиказького університету Брюс Річардсон провели 32 дні в Мамонтової печері (штат Кентуккі). Намагаючись переключитися на 28-годинний добовий цикл, вони хотіли довести, що добовий ритм людини - не властиве організму властивість, а реакція на навколишній світ. Але до однозначного висновку сміливі експериментатори прийти не змогли: молодий організм студента перебудувався на новий цикл, а ось сорокарічного Клейтманом це не вдалося. Крім того, дослідники не врахували, що будь-який світловий сигнал, а не тільки сонячне світло, може служити, кажучи науковою мовою, цайтгебером (нім. Zeitgeber - пристрій, що задає час).

У 1962 році німецький фізіолог Юрген Ашофф провів дослідження на своїх синів в підземному світло- і звуконепроникному бункері. Піддослідним дозволялося включати і вимикати світло відповідно до їхнього внутрішнього ритму. Ашофф записував цикли сну-неспання, температуру тіла, обсяг сечі та інші фізіологічні і поведінкові показники. Досліди Ашоффа довели: існує «вбудований хронометр», що дозволяє нам прокидатися без будильника, падаючих на обличчя променів сонця або підбадьорливого аромату звареної кави.

З експерименту Ашоффа був зроблений ще один дуже важливий висновок: внутрішнє час людини йде повільніше реального - воно запізнюється приблизно на годину. Такий вроджений ритм називається циркадних (лат. Сirca dies - близько доби). Внутрішні циркадні ритми рослин становлять 23-28 годин, а тварин - 23-25 ​​годин. Під впливом світлового дня циркадні ритми перетворюються в 24-годинні добові цикли. Циркадні ритми виявлені у всіх представників тваринного царства і на всіх рівнях організації.

У 1972 році американським дослідникам Роберту Муру і Віктору Ейхлеру вдалося показати, що циркадних ритмів ссавців управляє супрахіазматіческое ядро ​​(СХЯ), розташоване в головному мозку в підставі гіпоталамуса (див. «Наука і життя» № 1, 2005 р ). СХЯ людини являє собою сукупність близько 20 тисяч нейронів і налаштовується за допомогою зовнішніх сигналів, в основному денного світла. СХЯ обробляє інформацію про довжину світлового дня і посилає сигнал до органу проміжного мозку - епіфіз, де секретується гормон сну - мелатоніну. Але гіпоталамус реагує на зовнішні сигнали, а звідки ж береться внутрішній добовий ритм?

Перші докази генетичної природи циркадних ритмів були знайдені в 1971 році в експериментах з плодовою мушкою Drozophila malanogaster, які проводили Рон Конопка і Сеймур Бензер з Каліфорнійського технологічного інституту. Нормальна плодова мушка має 24-годинний ритм добової активності. Конопка виявив, що у одних мушок цей ритм зміщений в сторону зменшення (до 19 годин), а у інших - в бік збільшення (до 29 годин). Також в популяції були зовсім «неправильні» - аритмічний дрозофіли, у яких періоди сну і неспання чергувалися випадковим чином. За допомогою техніки картування генів (gene mapping) все три різні мутації були виявлені на одному і тому ж ділянці Х-хромосоми, який потім отримав назву Period або Per. Тобто все відхилення мушок від правильного циркадного поведінки обумовлені різними дефектами гена Per! Це був перший в світі часовий ген, який став відомий вченим. Після його клонування вдалося синтезувати білкову молекулу, за виробництво якої відповідає ген Per. Білок назвали PER (прописними буквами, щоб відрізнити від відповідного йому гена).

Подальші дослідження показали, що Per активний в основному в зорових клітинах дрозофіли, що не дивно. Виявилося, що білок PER проявляє циклічність: його максимальна концентрація реєструється в клітинному ядрі (тобто там, де проходить синтез білка) пізньої ночі. Відповідна йому мРНК - молекула, яка передає інформацію від гена Per рибосоми, на якій відбувається синтез білка PER, теж пульсує в добовому ритмі, але пік її концентрації припадає на 6 годин раніше, ніж у білкової молекули PER. Це і зрозуміло - спочатку активується ген, потім синтезується мРНК, а через деякий час в ядрах клітини починає напрацьовуватиметься білок.

Через кілька років після епохального відкриття Конопки у плодової мушки був виявлений ще один вартовий ген, названий Timeless (дочасний), скорочено - Tim. Причому для збереження нормальної добової активності мушкам необхідні і Tim і Per одночасно. Ще один вартовий ген - Frequency (частота), або Frq, був виявлений у нейроспори - різновиди міцеліальних грибів, іноді званих «червоною хлібної цвіллю». Настала черга відкриттів генетичних «годин» у ссавців.

На початку 1990-х років група дослідників з Національного центру біологічного часу (Північно-Західний університет, штат Іллінойс, США) під керівництвом Джозефа Такахаші вперше ідентифікувала мишачий годинний ген Сlock. Але чи означає це слово зовсім не «годинник», як можна було б подумати, воно являє собою абревіатуру від circa-dian locomotor output cycles kaput, що можна з натяжкою перевести як «циркадний переривник циклів рухової активності». У той час ще не була відпрацьована техніка нокауту (див. «Наука і життя» № 12, 2007 р ) - отримання тварин з «вибитим» геном. Тому маленька, на п'ять сторінок, стаття в журналі «Science» за 1994 рік на ділі представляла собою квінтесенцію праці величезної лабораторії протягом декількох років!

Ось коротка суть цієї роботи, яку варто викласти, хоча б для того, щоб зрозуміти ціну отриманого висновку: «... був виявлений ген, мутації в якому подовжують добовий цикл і скасовують його періодичність». У своїх дослідах американські дослідники використовували N-етил-N-нітрозілмочевіну (ЕНМ) - речовина, що взаємодіє з молекулою ДНК і викликає випадкові мутації. Самцям миші вводили ЕНМ, після чого в деяких сперматозоїдах виникали мутації. Потім мутантних самців схрещували зі звичайними, немутантний, самками. Народилося гетерозиготное потомство - тисячі і тисячі мишей. Цих мишей поміщали в «білячі» колеса і знімали діаграми активності при чергуванні світла і темряви і в повній темряві. У всіх мишей середнє значення циркадного ритму становила 23,7 години (стандартне відхилення 0,17 години). Несподівано виявили самця, чий добовий цикл склав 24,8 години. Тепер потрібно було зрозуміти, чи дійсно у нього є дефект в будь-якому часовому гені. Цього гомозиготного самця (++) схрестили з трьома звичайними гомозиготними самками (-). Отримали гетерозиготних (+ -) мишей потомства, цих мишей схрестили між собою, а потім знову протестували їх потомство на рухову активність. Так вдалося вивести гомозиготну (++) лінію чорних мутантних мишей з довгим циркадних циклом, які в повній темряві ставали «аритмічний». Тепер треба було визначити локалізацію мутантного гена, що викликає ці зміни в добовому ритмі життєдіяльності миші.

На той час була відома генетична карта всіх хромосом миші і хромосомні маркери-мітки (ділянки хромосом), що визначають якісь зовнішні фенотипічні особливості цієї лінії мишей. Наявність або відсутність генетичної мітки у нащадків «мічених» мишей легко визначалося «на око». Якщо маркер при схрещуванні втрачається, відбувається втрата відповідного зовнішнього ознаки. Група Такахаші провела генетичне картування годинного гена і визначила його місце розташування на хромосомі. Для цього чорних «аритмічних» мишей кілька разів схрещували з білими мишами, ділянки хромосом яких були помічені маркерами. Коли при схрещуванні зникають відразу дві ознаки, це означає, що у потомства відсутня ділянка хромосоми, що містить відразу два маркера. Так вдалося визначити локалізацію відсутнього генетичного ділянки і, отже, місце розташування нового часового гена Clock, що відповідає за стійкість циркадного ритму миші.

Сьогодні, коли геном миші розшифрований повністю, визначити нуклеотидну послідовність відрізка ДНК між маркерами досить легко. Але 15 років тому, коли проводилося це дослідження, вченим доводилося секвенувати ділянки ДНК, що містять часові гени, самостійно.

П'ятнадцять років тому робота по визначенню одного мутантного гена займала кілька років. Тепер з'явився новий потужний інструмент досліджень - стало можливим «вимкнути» будь-якої ген миші і подивитися, як це відбивається на її поведінці. Для визначення одного часового гена потрібно «всього» 1-2 роки роботи декількох дослідників. З кінця 1990-х років було відкрито ціле сімейство годинних генів ссавців: ген Bmal, що працює в парі з геном Per, гени Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 і деякі інші.

Отже, гени, які контролюють добову активність живої клітини, відомі. А яким чином працює цей молекулярний хронометр? Розповідає один з відомих фахівців в області вивчення молекулярного механізму циркадний активності, керівник групи циркадних ритмів Інституту біофізичної хімії Макса Планка в Геттінгені (Німеччина) Хенрік Остер:

«Останнім часом стало відомо, що з невеликими варіаціями« внутрішньоклітинний хронометр »працює однаковим чином у всіх вивчених клітинах, включаючи нейрони СХЯ. Внутрішні «годинник» є не тільки в клітинах живих істот, але і в клітинних культурах, які вирощуються в лабораторії.

Молекулярні циркадні годинник представляють собою цикл активації годинних генів, яка поступово послаблюється через механізм зворотного зв'язку. Білки-активатори BMAL1 і CLOCK зв'язуються з регуляторним ділянкою ДНК (E-box), при цьому «включаються в роботу» вартові гени Per і Cry (Cryptochrome). Це відбувається рано вранці. Через 2 години після активації годинних генів в клітці спостерігається пік концентрації відповідних мРНК, а до полудня напрацьовується максимальну кількість білків PER і CRY. Ці білкові молекули спочатку накопичуються в клітинній цитоплазмі, а в нічний період поступово повертаються в ядро ​​і гасять активність білків BMAL1 і CLOCK, утворюючи з ними міцний комплекс, що призводить до блокування генів Per і Cry. Потім білки PER і CRY поступово розпадаються, і молекули BMAL1 і CLOCK вивільняються, щоб почати новий добовий цикл в клітці - включити годинні гени Per і Cry. Сумарна тривалість такого циклічного процесу становить близько 24 годин.

У подібному молекулярному циклі задіяні і інші відомі годинні гени. Більш того, 8-10% всіх активних (не тільки часових) генів осцилюють в добовому ритмі. Наприклад, в печінці процеси гліколізу, метаболізму жирних кислот, глюконеогенез відбуваються з періодичністю 24 години.

Крім того, за останніми даними, СХЯ у відповідь на світловий сигнал - цайтгебер посилає якісь невідомі хімічні сигнали, які активують вироблення кортиколиберина, а той в свою чергу - гипофизарного адренокортикотропного гормону (АКТГ). Концентрація АКТГ в крові коливається циклічно, досягаючи максимуму в 6-8 годин ранку. Як відомо, АКТГ дуже важливий для організму, він стимулює синтез глюкокортикоїдів (кортизолу, альдостерону і ін.) В корі надниркових залоз, виконує і інші регуляторні функції. Вартові гени управляють фізіологією наднирників, циклічним викидом адреналіну.

Сигнальні шляхи, які беруть участь у передачі тимчасової інформації з центрального координуючого органу - гіпоталамуса - в інші місця, задіяні в механізмі осциляцій всіх органів, поки мало вивчені. Це - предмет досліджень нашої групи ».

***

Організм людини складається з десятка трильйонів клітин, а значить, з трильйонів беззвучних біологічного годинника, який відраховує час незалежно від світлового дня. За їх ходом невсипно спостерігає скупчення мозкових клітин - десь на рівні перенісся - 20 тисяч нейронів СХЯ. Вони відповідають за те, щоб всі годинники в органах і клітинах включалися в роботу по світловому сигналу - вчасно і чітко. Для синхронізації годинника організму в крові присутні спеціальні речовини, про які поки ми знаємо дуже мало. Але скоро дізнаємося, без сумніву.

Автор висловлює подяку Хенрику Остеру за ґрунтовне інтерв'ю і люб'язно надані ілюстрації.