НОВІ МОЖЛИВОСТІ В РАННЬОЇ діагностики туберкульозної інфекції в ДІТЕЙ Омської області

1. бібліографічна ПОСИЛАННЯ

1 Плеханова М.А. 1 Кривцова Л.А. 1 білково Т.Н. 1 Дакуко А.Н. 1 Оксеньчук Т.В. 1 Гончарова Т.А. 1

1 ФГБОУ ВО Омський державний медичний університет МОЗ Росії

В даний час великий інтерес представляє вивчення іммуноген¬ності різних антигенів M. tu-berculosis у хворих актів¬ним туберкульозом для підвищення специфічності і чутливості діагностичних тестів. Метою цього дослідження було оцінити антигени мікобактерій туберкульозу для ранньої діагностики туберкульозної інфекції у дітей. Для цього були обстежені 54 дітей у віці до 17 років, з них у 25 дітей (46,3%) встановлено туберкульоз, 13 дітей (24,1%) склали групу високого ризику з неуточненими діагнозом туберкульозу, 11 дітей (20,4% ) - з латентною туберкульозною інфекцією та 5 (9,2%) - не інфікованих МБТ. Всім дітям, крім загальноприйнятих досліджень, проведені специфічні тести in vitro за визначенням гамма-інтерферону в цільної крові після 72-годинної стимуляції туберкуліном і рекомбінантними антигенами мікобактерій туберкульозу (ESAT6, 85а, CFP32B, Rv2660c, ЕSAT6-CFP10). Аналізуючи отримані результати, встановили, що зберіг свою значущість туберкулін для оцінки напруженості специфічного імунітету. Антигени ESAT6 і Rv2660c з'явилися найбільш значущими для діагностики латентної туберкульозної інфекції, а гібридний білок ЕSAT6-CFP10 - для діагностики туберкульозу.

діти

туберкульоз

латентна туберкульозна інфекція

специфічні антигени: ППД-л

esat6

85а

cfp32b

rv2660c

еsat6-cfp10

специфічні тести in vitro для визначення інтерферону-гамма

1. Лозівська М.Е. Порівняльний аналіз результатів тестів in vitro «Квантіферон» і «Тубінферон» і шкірної проби з Діаскінтест / М.Е. Лозівська [и др.] // Збірник тез II Конгресу національної асоціації фтизіатрів. - СПб., 2013. - С. 111.

2. Пат. 2586279 Російська Федерація. МПК G01N 33/535 Спосіб оцінки активності туберкульозної інфекції у дітей та підлітків / М.А. Плеханова [и др.]; ФГБУ «ФНІЦЕМ ім. Н.Ф. Гамалії »МОЗ Росії (RU). - № 2015124784/15; заяв. 24.06.2015; опубл. 10.06.2016. - Бюл. № 16. - 10 с.

3. Плеханова М.А. Проба Манту з 2 ТО туберкуліну ППД-Л і / або проба з Діаскінтест? / М.А.Плеханова // Збірник матеріалів XVII Конгресу педіатрів Росії з міжнародною участю «Актуальні проблеми педіатрії», Москва, 14-16 лютого 2014 року - М., 2014. - С. 259.

4. Федеральні клінічні рекомендації з діагностики та лікування латентної туберкульозної інфекції у дітей. - М .: РООІ «Здоров'я людини», 2015. - 36 с.

5. Фтизіатрія. Національне керівництво: з дод. на компакт-диску / Ассоц. мед. о-в за якістю, Рос. т-во фтизіатрів // під ред. М.І. Перельмана. - М .: ГЕОТАР-Медіа, 2010. - 504 с. : Ил.

6. Al-Zamel, FA Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis / FA Al-Zamel // Expert Rev Anti Infect Ther. - 2009. - Vol. 7, № 9. - P. 1099-1108.

7. Andersen, Р. The prognosis of latent tuberculosis: can disease be predicted? // Р. Andersen [et al.] // Trends. Mol. Med. - 2007. - Vol. 13, № 5. - P. 175-182.

8. Byun E.-H. Mycobacterium tuberculosis Rv0577, a novel TLR2 agonist, induces maturation of dendritic cells and drives Th1 immune response / E.-H.Byun, [et al.] // FASEB J. - 2012. - V. 26. - P. 2695- 2711.

9. Ehlers S. The granuloma in tuberculosis: dynamics of a host-pathogen collusion / Stefan Ehlers, Ulrich E. Schaible // Frontiers in Immunology. - January, 2013. - Vol. 3, Article 411. - P. 1-9.

10. Gamma Interferon Release Assays for Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection / Madhukar Pai [et al.] // Clinical Microbiology Reviews. - January, 2014. -Vol. 27, № 1. - P. 3-20.

11. Huard RC The Mycobacterium tuberculosis complex-restricted gene CFP32 encodes an expressed protein that is detectable in tuberculosis patients and is positively correlated with pulmonary interleukin-10. / RC Huard [et al.] // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71. - P. 6871-6883.

12. Mustafa, AS Immunoge¬nicityof Mycobacterium tuberculosis RD1 regiongene productsininfected cattle / AS Mustafa [et al.] // Clin. Experim. Immunol. - 2002. - Vol. 130. № 1. - P. 37-42.

13. Pinto LM Immunodiagnosis of tuberculosis: State of the Art / LM Pinto, J. Grenier, SG Schumacher // Med. Princ. Pract. - 2012. - № 21. - P. 4-13.

14. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans / LD Jasenosky [et al.] // Immunol. Rev. - 2015-го, Mar. - № 264 (1). - Р. 74-87.

15. Venturini E. What steps do we need to take to improve diagnosis of tuberculosis in children? / E. Venturini, G. Remaschi, E. Berti // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. - 2015-го, Jul. - № 13 (7). - Р. 907-922.

Основними методами активного виявлення туберкульозної інфекції у дітей в Росії залишаються проба Манту з 2 ТО туберкуліну ППД-Л (туберкулін) і Діаскінтест (ДСТ) [3, 4].

В якості альтернативних специфічних тестів останнім часом в нашій країні використовуються тести in vitro. Гібрид двох антигенів - ESAT6 і CFP10 - включений в специфічні діагностичні тести, засновані на продукції ІФН-g у відповідь на стимуляцію цими антигенами (IGRA - Interferon Gamma Release Assays) [7]. Тести IGRA виявилися високоспеціфічнимі (до 99%), але мали низьку чутливість [1, 5, 13].

Для підвищення специфічності і чутливості імуноферментного аналізу (ІФА) тривають пошуки більш специфічних антигенів, в тому числі отриманих генно-інженерним шляхом [6]. Серед кількох груп антигенів M. tuberculosis з протективной активністю центральне місце займають секретуються білки [12].

Нещодавно у осіб, інфікованих МБТ, був виявлений білок CFP32 [11]. За результатами ІФА у 32% хворих на легеневу форму туберкульозу в сироватці виявлялися антитіла проти CFP32, а сам білок виявлявся в сироватці 56% хворих [11]. Результати іншого дослідження показали, що CFP32 (також відомий як Rv0577 і TB27.3) міг регулювати вроджений і адаптивний імунітет [8].

Група вчених під керівництвом професора Андерсена (2011) виявила шість генів, експресія яких не залежала від стадії інфекції, і продуктом одного з цих генів був білок Rv2660c. У дослідженнях Stefan Ehlers і Ulrich E. Schaible (2013) Rv2660c визначався протягом усього періоду інфекції у мишей, але при цьому залишався слабким індуктором ІФН-g [9].

Таким чином, незважаючи на проведені дослідження, дані по специфічних антигенів суперечливі; потрібне подальше їх вивчення.

Мета дослідження

Оцінка специфічних антигенів для ранньої діагностики туберкульозної інфекції у дітей.

Матеріал і методи дослідження

У дослідження були включені 54 дитини у віці від 1 року до 17 років. Основна частина дітей (N = 54, n = 38; 70,4%) була госпіталізована в спеціалізовану туберкульозну дитячу клінічну лікарню м.Києва в 2014-2016 рр., З них 65,8% дітей (N = 38, n = 25 ) з підтвердженим діагнозом туберкульозу (ТБ) (група «ТБ»), 34,2% дітей (N = 38, n = 13) з групи високого ризику по ТБ (група «ГР ТБ»): діти з контакту з хворим ТБ ( N = 13, n = 8; 61,5%) і інфіковані МБТ з ознаками активності туберкульозної інфекції (N = 13, n = 9; 69,2%), в двох випадках (N = 13, 15,4%) були локальні зміни в легеневій тканині, без ознак активності туберкульозної інфекції. Серед дітей з підтвердженим діагнозом ТБ в 24% (N = 25, n = 6) встановили інфільтративний туберкульоз легенів (ВТТ), в 4% (N = 25, n = 1) - дисемінований туберкульоз легень, в 32% (N = 25 , n = 8) - первинний туберкульозний комплекс (ПТК) і в 40% (N = 25, n = 10) - туберкульоз внутрішньогрудних лімфатичних вузлів (ТВЛУ). Туберкульоз в фазі інфільтрації був встановлений у 68% пацієнтів (N = 25, n = 17), в фазі розпаду - у 8% (N = 25, n = 2), в фазі обсіменіння - у 4% (N = 25, n = 1) і кальцинації - у 20% (N = 25, n = 5). У більшій частині дітей, хворих на ТБ (35, 92,1%), бактеріовиділення не реєстрували (МБТ-).

В амбулаторних умовах було обстежено 29,6% дітей (N = 54, n = 16), з них 31,3% пацієнтів (N = 16, n = 5) були інфіковані мікобактеріями туберкульозу (МБТ) (група «НТ») , при цьому в 18,7% (N = 16, n = 3) встановили поствакцинальную алергію. У 68,7% пацієнтів (N = 16, n = 11) було встановлено інфікування МБТ - латентна туберкульозна інфекція (група «ЛТИ»), з них в 31,3% випадків (N = 16, n = 5) інфіковані МБТ були протягом року, в 37,5% (N = 16, n = 6) понад рік.

Діагноз ТБ грунтувався на результатах клінічних, лабораторних, в тому числі бактеріологічних (бактеріоскопія на кислотостійкі мікобактерії - забарвлення мазка патологічного матеріалу по Ціль-Нільсеном, посів на МБТ - на рідкі середовища системи Bactec 960 і тверді середовища Левенштейна-Йенсена), молекулярно-генетичних ( ПЛР на ДНК до МБТ), променевих (рентгенографія органів грудної клітини, проста томографія і мультиспіральна комп'ютерна томографія органів грудної клітки, ультразвукове дослідження органів черевної порожнини) методів. Враховувалися результати туберкулінодіагностики (проба Манту з 2 ТО туберкуліну ППД-Л) і проби з ДСТ.

Додатково всім дітям було проведено специфічне імунологічне дослідження. Дослідження включало визначення ІФН-g в цільної крові після 72-годинної індукції специфічними антигенами: ППД-Л, CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85а, ESAT6-CFP10. Оцінку рівня специфічного ІФН-g проводили за визначенням індексу стимуляції (і.с.) і в пг / мл [2]. Специфічні антигени (CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85а, ESAT6-CFP10) були виділені в лабораторії трансляційній біомедицини відділу генетики та молекулярної біології бактерій ФНІЦ епідеміології та мікробіології імені Н.Ф. Гамалії.

Розмір вибірки пацієнтів, мінімально достатній для отримання доказових даних, був розрахований в програмі OpenEpi, версії 3. Отримані дані оброблялися з використанням статистичних програм Statistica 6,0 і Biostat.

На проведення даного дослідження отримано дозвіл етичного комітету Омської державної медичної академії (протокол № 51 від 10.10.2012 р). Для участі дітей в імунологічному дослідженні від батьків або їх законних представників було отримано добровільну інформовану згоду.

Публікація підготовлена ​​в рамках підтриманого НАН наукового проекту № 16-16-55001 (дослідження проведено за рахунок коштів обласного бюджету Омської області та Фонду).

Результати дослідження та їх обговорення

Середній вік дітей, включених в дослідження, склав 6,9 ± 0,7 років, дівчаток було 53,7% (N = 54, n = 29) і хлопчиків 46,3% (N = 54, n = 25). Половина дітей була з соціально-благополучних сімей (N = 54, n = 27). З соціально-неблагополучних сімей в основному були діти з встановленим діагнозом ТБ (р = 0,005), також частіше ці діти були з сімейного (р = 0,015), бацилярних (р = 0,013) вогнища туберкульозу. Серед дітей з ЛТИ частіше реєстрували обтяжений алергологічний анамнез (р = 0,001), часті респіраторні захворювання (р = 0,027).

Серед дітей, хворих на ТБ, рівень чутливості до ППД-Л був достовірно вище, ніж серед дітей з ЛТИ і не інфікованих МБТ (р <0,05). В цілому позитивні реакції реєструвалися у більшої частини дітей, хворих на туберкульоз, з ЛТИ і з групи ризику.

Оцінюючи чутливість до ДСТ, встановили статистично значущі відмінності за рівнем відповіді до рекомбінантного алергену серед дітей, хворих на ТБ і ЛТИ, і не інфікованих МБТ (р <0,0001). Були відсутні відмінності і серед дітей з групи «ТБ» і групи «ГР ТБ» (р = 0,167), що свідчило про високу активність туберкульозної інфекції та необхідності виключення локального туберкульозного процесу. Також не виявили значущих відмінностей за рівнем чутливості до ДСТ серед дітей з ЛТИ і не інфікованих МБТ (р = 0,472). У більшій частині дітей, як хворих на ТБ, так і групи ризику по ТБ, відзначили гіперергічні реакції на ДСТ, серед дітей з ЛТИ ці реакції не реєструвалися.

Рівень продукції індукованого ІФН-g в цільної крові представлений в таблиці 1. Індукція проведена специфічними антигенами: ППД-Л, ESAT6, 85а, ЕSAT6-CFP10, CFP32B, Rv2660c.

Таблиця 1

Рівень специфічного ІФН-g у дітей, досліджуваних груп (пг / мл)

антигени

ТБ *, n = 25

ЛТИ *, n = 11

НТ *, n = 5

ГР ТБ *, n = 13

Критерій Краскела-Уолліса (H), р

ME (Q25%: Q75%)

ME (Q25%: Q75%)

ME (Q25%: Q75%)

ME (Q25%: Q75%)

ППД-Л

661,9

(159: 1010)

95

(15,6: 122)

0

539,8

(156: 691)

H = 22,663; р = 0,000

ESAT6

14,5

(0:19)

65,9

(3,5: 75)

14

(0: 0)

41,2

(0:43)

H = 5,739; р = 0,165

85а

12,8

(0: 6)

18,4

(0: 9,5)

8,8

(0: 4)

5,8

(0: 3)

H = 2,029; р = 0,775

ЕSAT6-CFP10

90

(6: 131)

0,1

(0: 0)

0

101,5

(0: 143)

H = 24,681; р = 0,000

CFP32B

14,9

(0:31)

38,5

(1: 52,5)

11

(0: 0)

18,3

(3,5: 27)

H = 3,288; р = 0,473

Rv2660c

32,6

(0:18)

94,1

(9: 171)

22

(0: 0)

46,9

(9:60)

H = 9,978; р = 0,024

Примітка: * ТБ - хворі на туберкульоз; ЛТИ - латентна туберкульозна інфекція; НТ - не інфіковані МБТ; ГР ТБ - група ризику по туберкульозу.

Так, серед дітей, хворих на ТБ, рівень ІФН-g (пг / мл) статистично значимо відрізнявся від показників дітей з ЛТИ (РТБ ЛТИ = 0,001) і не інфікованих МБТ (РТБ НТ = 0,014). Чи не були встановлені відмінності показників дітей, хворих на ТБ, і з групи ризику по ТБ (р = 0,311), що підтверджувало високий ризик розвитку захворювання. Результати і.с. виявилися більш інформативними для визначення ЛТИ і менш значущими для оцінки активності туберкульозної інфекції (Н = 3,141; РТБ ЛТИ-ГР ТБ = 0,208), що підтвердила і установленая помірна кореляція (по Спирмену, r = 0,49, р = 0,004) між показниками ІФН-g індукованого ППД-Л (і.с.) і проби Манту з 2 ТО туберкуліну ППД-Л (мм).

Оцінюючи результати гібридного білка (ЕSAT6-CFP10) в якості митогена, встановили статистично значущі відмінності між показниками (і.с.) дітей, хворих на ТБ, з ЛТИ (РТБ ЛТИ = 0,003) і не інфікованих МБТ (РТБ НТ = 0,043) . При цьому у дітей з групи ризику по ТБ що не встановили відмінностей (РТБ ГР ТБ = 0,364), що також підтверджувало високий ризик розвитку захворювання. Показники не розрізнялися у дітей з ЛТИ і не інфікованих МБТ. Була встановлена ​​помірна кореляція (по Спирмену, r = 0,27, р = 0,04) між показниками ІФН-g індукованого ЕSAT6-CFP10 (і.с.) і проби з ДСТ (мм).

Оцінюючи результати рівня ІФН-g після індукції ESAT6, що входить до складу гібридного, встановили статистично значущі відмінності в групах «ТБ» і «ЛТИ», при цьому показник індексу стимуляції був нижче у дітей з встановленим ТБ і вище у дітей з ЛТИ (рТБ- ЛТИ = 0,035), а при відсутності туберкульозної інфекції (РТБ НТ = 0,902) і при високому ризику захворювання показники достовірно не розрізнялися (РТБ ГР ТБ = 0,066). Результати рівня ІФН-g після індукції антигеном 85а (і.с.) в групах порівняння статистично не розрізнялися (H = 2,581; р = 0,528).

Рівень ІФН-g після індукції CFP32B (і.с.) у пацієнтів з групи «ЛТИ» статистично значимо не відрізнявся від показників у дітей з груп «ТБ» (р = 0,07), «НТ» (р = 0,383) і «ГР ТБ» (р = 0,256). Визначили пряму залежність між рівнем ІФН-g після індукції білком ЕSAT6 і CFP32B (r = 0,80). Отримані результати по антигену CFP32B дозволили його розглядати як білок ранній стадії туберкульозної інфекції.

За результатами дослідження встановили високий рівень ІФН-g при індукції Rv2660c у пацієнтів групи «ЛТИ», і.с. склав 7,2 ± 2,5 (Q25%: Q75% 0,5: 15), який статистично значимо відрізнявся від рівня у пацієнтів групи «ТБ» (і.с. 2,3 ± 0,8, Q25%: Q75 % 0: 1,3), р = 0,016. Показник не визначався в групі «НТ», рівень ІФН-g в групі «ГР ТБ» відповідав значенню групи «ТБ». Визначаючи кореляцію між показником (і.с.), отриманим після індукції ЕSAT6, і показником рівня ІФН-g при індукції Rv2660c, встановили статистично значущу помірну залежність (r = 0,396, р = 0,005). Також встановили, що існувала пряма статистично значуща помірна залежність між показниками ІФН-g при індукції Rv2660c і CFP32B (r = 0,561, р = 0,00002). Тому антиген Rv2660c, так само як і CFP32B, віднесли до білка ранній стадії туберкульозної інфекції.

Отримані нами дані підтвердили роль антигенів CFP32B і Rv2660c як білків ранній стадії туберкульозної інфекції [8, 9]. При цьому, на відміну від експериментальних досліджень, проведених Stefan Ehlers і Ulrich E. Schaible (2013) [9], антиген Rv2660c показав себе як сильний індуктор ІФН-g в період латентної туберкульозної інфекції та визначався у більшої частини дітей групи «ЛТИ» ( 63,6%). При цьому даний антиген показав себе слабким індуктором при розвитку туберкульозу, що дозволило його рекомендувати для ранньої діагностики туберкульозної інфекції. Антиген CFP32B, на відміну від Rv2660c, виявлявся з однаковою частотою у дітей групи «ТБ» (28%) і «ЛТИ» (27,3%), незважаючи на тенденцію до більш вираженого відповіді індукованого ІФН-g в групі «ЛТИ» ( р = 0,07).

Серед дітей групи «ЛТИ» основне діагностичне значення для латентної туберкульозної інфекції мала реакція при стимуляції Rv2660c. Також для дітей даної групи інформативна була реакція при стимуляції антигеном ESAT6. За результатами ранжування дані показники мали найбільше значення. Так, для Rv2660c середній ранг склав 4,3 од, для ESAT6 - R 4,25, найменше значення мав показник після індукції ЕSAT6-CFP10 - R 1,6.

Широко застосовуються в даний час методи in vivo і in vitro для діагностики туберкульозної інфекції, за результатами метааналізу 2015 року, не дозволяли диференціювати латентну та активну [15]. За нашими дослідженнями, для активної туберкульозної інфекції діагностичну значимість мав антиген ЕSAT6-CFP10 (при определеніїі рівня ІФН-g), позитивні реакції відзначили у 84% дітей групи «ТБ» (р = 0,000), при цьому у дітей групи «ЛТИ» позитивних реакцій не було зареєстровано, що дозволило рекомендувати включити даний антиген в комплекс специфічного обстеження для виключення ЛТИ у дітей. Результати тесту після стимуляції ППД-Л (по і.с.) виявилися менш значимими для оцінки активності туберкульозної інфекції (р = 0,208), незважаючи на більш виражені реакції. З огляду на, що при відсутності інфікування МБТ реєструвалися тільки негативні реакції на ППД-Л, тести з ППД-Л можна розглядати як скринінгові при відборі дітей для необхідності подальшого специфічного обстеження.

Таким чином, проблема ранньої діагностики туберкульозної інфекції у дітей може бути вирішена при включенні в діагностичний алгоритм визначення рівня ІФН-g після індукції такими специфічними антигенами, як ППД-Л, ESAT6, Rv2660c, ЕSAT6-CFP10, і його комплексної оцінки.

висновок

Аналізуючи специфічні антигени для ранньої діагностики туберкульозної інфекції у дітей, встановили, що антигени ESAT6, Rv2660c були значущими в діагностиці латентної туберкульозної інфекції, а гібрид ЕSAT6-CFP10 - в діагностиці туберкульозу. Для оцінки напруженості специфічного імунітету зберіг свою значущість і туберкулін. Тому включення в комплекс діагностичних заходів імунологічного тесту по визначенню рівня ІФН-g, індукованого даними специфічними антигенами, дозволить оптимізувати діагностику туберкульозної інфекції у дітей для своєчасного проведення профілактичних заходів.

бібліографічна ПОСИЛАННЯ

Плеханова М.А., Кривцова Л.А., білково Т.Н., Дакуко А.Н., Оксеньчук Т.В., Гончарова Т.А. НОВІ МОЖЛИВОСТІ В РАННЬОЇ діагностики туберкульозної інфекції в ДІТЕЙ Омської області // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 6.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25797 (дата звернення: 24.07.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)