Біоінформаційний аналіз молекулярно-генетичних процесів при взаємодії В1- і гамма-дельта-Т-лімфоцитів

В1-лімфоцити є окремою субпопуляцію B-клітин в організмі людини і мишей. Вони задіяні в першій лінії захисту організму від інфекцій - здатні відповідати на Т-незалежні (ТН) антигени 2-го типу (без участі Т-клітин).
В1-лімфоцити локалізуються переважно в серозних порожнинах (черевній і плевральній) і лімфоїдної тканини слизових оболонок. У слизовій оболонці кишечника В1-клітини виробляють значну частину імуноглобуліну (Ig) А.
Для перемикання ізотипів імуноглобулінів потрібні сигнали від Т-лімфоцитів, однак в тонкій кишці перемикання изотипа з IgM на IgA відбувається в tн-В1-клітинах, які не отримують допомоги Т-клітин. Передбачається, що в цьому процесі можуть брати участь гамма-дельта-Т-лімфоцити, які, так само як B1-лімфоцити, в онтогенезі з'являються раніше інших Т-клітин і мають схожу з В1-клітинами локалізацію в організмі. Встановлення механізмів взаємодії В1- і гамма-дельта-Т-лімфоцитів при імунній відповіді на ТН-2-антигени є актуальним завданням. Для прогнозування можливих шляхів такого взаємодії застосовували біоінформаційний аналіз.
Проведене дослідження дозволило отримати дані про клітинних маркерах і ключових сигнальних шляхах, які можуть бути залучені в це взаємодія, а також про регуляторних внутрішньоклітинних структурах - малих РНК, які здатні впливати на окремі компоненти сигнальних шляхів.

Мал. 1. Карта експресійних мішеней канонічного сигнального шляху для В1-клітин

Мал. 2. Карта експресійних мішеней канонічного сигнального шляху для гамма-дельта-Т-лімфоцитів

Вступ

В1-клітини - окрема субпопуляція B-лімфоцитів в організмі людини і мишей.

На відміну від B2-клітин, представлених переважно в селезінці, лімфовузлах та кістковому мозку, В1-лімфоцити локалізуються в серозних порожнинах (перитонеальній та черевної), а також в лімфоїдної тканини слизових оболонок, зокрема в слизовій оболонці кишечника.

В онтогенезі В1-клітини з'являються раніше В2-лімфоцитів. Попередники В1-клітин мігрують з фетальної печінки в серозні порожнини. Вважається, що вони можуть зберігатися протягом всього життя. Це підтверджується зародкової організацією генів імуноглобулінів (Ig) В1-клітин. Однак отримані дані про те, що принаймні частина В1-клітин дорослого організму може утворюватися в кістковому мозку.

В1-лімфоцити відповідають переважно на Т-незалежні (ТН) антигени 1-го і 2-го типів.

ТН-1-агенти в досить високих концентраціях здатні індукувати поліклональних активацію B-лімфоцитів (зрілих і незрілих) і продукцію Ig. Класичним прикладом ТН-1-антигену служить липополисахарид.

ТН-2-агенти мають переважно небілкову природу, великий розмір молекул і регулярно повторювані епітопи, внаслідок чого здатні викликати кластеризацию іммуноглобулінових рецепторів на поверхні В-клітин. В результаті формується сигнал досягає сили, достатньої для активації лімфоцита, і другого сигналу від Т-клітини не потрібно (це визначає Т-незалежність відповіді). ТН-2-агенти на відміну від ТН-1-агентів здатні активувати В-клітини тільки специфічно, тому на них відповідають переважно B1-лімфоцити, здатні до ТН-відповіді [1].

IgA - основний ізотип імуноглобулінів в слизових оболонках, який грає ключову роль в нормальному функціонуванні організму. Зокрема, IgA перешкоджає проникненню патогенів в організм через слизові оболонки. S. Wolbank і співавт. встановили, що антитіла 2F5IgA, 2F5IgM і 2G12IgM ефективно інгібують перші стадії проникнення ВІЛ через слизові оболонки [2].

Велика частина IgA виробляється в слизовій оболонці кишечника, переважно B1-клітинами. Освіта В1-лімфоцитами IgA в тонкій кишці свідчить про те, що в ТН-В1-клітинах відбувається перемикання изотипа з IgM на ізотип IgA [3]. При відповіді на Т-залежні (ТЗ) антигени для перемикання ізотипів В2-лімфоцит має отримати другий сигнал від Т-клітини. Чим за відсутності класичної допомоги Т-клітин забезпечується перемикання класів імуноглобулінів в В1-клітинах і як воно здійснюється, в даний час не відомо. Передбачається, що в цьому процесі можуть брати участь гамма-дельта-Т-клітини [4-6].

Гамма-дельта-Т-лімфоцити стали активно вивчатися недавно. На даний момент виявлено їх здатність розпізнавати деякі антигени і виступати в ролі антігенпрезентірующіх клітин (АПК). Крім того, вони мають цитотоксичні властивості, тому розглядаються як потенційні терапевтичні мішені [7].

Гамма-дельта-Т-лімфоцити, так само як B1-лімфоцити, утворюються в онтогенезі раніше інших Т-лімфоцитів. Вони локалізуються переважно на шкірі і слизових оболонках, в тому числі в лімфоїдної тканини, що асоціюється зі слизовою оболонкою кишечника.

Недостатність популяції інтраепітеліальних гамма-дельта-Т-клітин може зумовити розвиток некротичних ентероколітів [8], що свідчить про регуляторних властивостях цих клітин.

Здатність гамма-дельта-Т-клітин впливати на утворення антитіл В1-клітинами прямої експериментальної перевірці не піддавалася, і питання про їх роль в перемиканні синтезу з IgM на IgA в В1-клітинах кишечника і раніше залишається відкритим. Однак є достатня кількість повідомлень про вплив деяких субпопуляцій гамма-дельта-Т-клітин на рівень нормальних імуноглобулінів в організмі [9].

Вивчення особливостей перемикання на IgA B1-клітин кишечника дозволить розробити нові терапевтичні підходи до лікування захворювань кишечника інфекційної і неінфекційної природи. З огляду на високу затратність експериментальних досліджень, уявлялося необхідним звузити коло завдань і використовувати біоінформаційні методи аналізу.

Метою даної роботи стало проведення біоінформаційного аналізу для виявлення можливих шляхів взаємодії B1-лімфоцитів з гамма-дельта-Т-клітинами, які можуть мати відношення до гуморального імунної відповіді на ТН-2-агенти, а також ролі малих РНК (miRNA) в продукції антитіл , активації і проліферації B1-клітин.

Матеріал і методи

У біоінформаційному дослідженні використана програма Pathway Studio® і реферативна база даних ResNet® компанії Ariadne Genomics (США).

Об'єктами вивчення стали анотації біологічних об'єктів (зокрема, білків, клітинних процесів і хвороб), а також функціональні зв'язки між ними, сформовані в результаті обробки текстового масиву повнотекстових статей і абстрактів, індексованих в MEDLINE.

В якості моделі випадкового перетину множин використовувалося гипергеометрическое розподіл. Розподіл процесів за пріоритетами проводилося програмою. Чим менше значення p, тим більша ймовірність, що гени, що потрапили в конкретний процес, віднесені до нього не випадково. Результат вважався значущим при p = 0,01. Зі збільшенням генеральної сукупності значення p зменшується, то є ймовірність того, що в довільній вибірці кількість зазначених об'єктів не випадково, зростає.

Результати та їх обговорення

Нами проаналізовано список генів (база даних ResNet®), що мають відношення до В1- і гамма-дельта-Т-клітинам, транскрипція яких достовірно регулюється внутрішньоклітинними сигнальними каскадами, описаними в літературі.

Результати проведеної роботи підтвердили, що гамма-дельта-Т-клітини беруть участь у функціонуванні В1-лімфоцитів. На малюнку 1 представлені можливі шляхи взаємодії цих субпопуляцій.

Один з таких сигнальних шляхів призводить до продукції IgM. Як було зазначено раніше, B1-клітинам для відповіді на антиген і синтезу / секреції антитіл не потрібна допомога класичних Т-клітин. ТН-2-антиген альфа (1 → 3) декстран завдяки своїй структурі з регулярно повторюваними однаковими епітопами викликає перехресне зв'язування (кластеризацию) декількох комплексів BCR і таким чином забезпечує сигнал, достатній для активації В1-лімфоцитів. Першими утворюються IgM-антитіла.

Важливу функцію в перемиканні ізотипів імуноглобулінів В-клітинами з IgM на інші класи виконує индуцированная активацією цітідін дезамінази (AID). AID бере участь в соматичному гіпермутірованіі (SHM), конверсії генів і рекомбінації при перемиканні ізотипів імуноглобулінів в B-клітинах імунної системи. В даний час AID визнана основним ферментом, що забезпечує різноманітність ізотипів імуноглобулінів.

У мишей з вродженим дефіцитом AID кількість непатогенних анаеробних бактерій у тонкій кишці збільшено. Крім того, у них утворюється багато лімфоїдних фолікулярних структур, що вистилають тонку кишку. У пацієнтів з імунодефіцитом змінена кишкова мікрофлора. Дисбаланс мікрофлори кишечника та інших слизових оболонок пов'язаний з блокуванням AID-опосередкованої рекомбінації при перемиканні изотипа (для отримання IgA) в В-лімфоцитах [10].

Механізм дії AID полягає в заміні цитидину на уридин в молекулі ДНК, що призводить до точкових мутацій і рекомбінації генів імуноглобулінів.

Результати проведеного біоінформаційного аналізу продемонстрували, що AID відіграє велику роль у функціонуванні В1-клітин.

Нами встановлено, що транскрипційні фактор каппа-бі (NF-κB) сприяє індукції AID в В1-клітинах, а також інтерлейкінів (IL) 2 і 4 Т-лімфоцитами. IL-2 впливає на диференціювання і проліферацію Т-лімфоцитів, виробляється Т-клітинами у відповідь на антигенну і мітогеном стимуляцію. Для освіти IL-2 гамма-дельта-Т-клітинами потрібна стимуляція через CD28 [11]. Інший цитокин, що виробляється Т-клітинами, - IL-4. Він регулює ріст і диференціювання В-лімфоцитів, а також процеси біосинтезу і секреції антитіл. Встановлено, що його можуть виробляти гамма-дельта-Т-лімфоцити, зокрема, при контактних дерматитах, викликаних стероїдами [12].

Таким чином, дані, отримані за допомогою біоінформаційного аналізу, дозволяють спрогнозувати вплив гамма-дельта-Т-клітин на B1-лімфоцити за допомогою вироблення IL-2 і -4.

Був виявлений також ряд маркерів, залучених в функціональну активність В1-лімфоцитів. Розпізнавання IL-2 рецепторами (IL-2RG і IL-2RB) призводить до активації тирозинкіназ JAK1 і JAK3. Активація JAK1 відбувається також при активації рецептора IL-4 (IL-4R). JAK1 і JAK3 забезпечують фосфорилювання STAT6 і STAT5A, за рахунок чого відбувається активація AID і RAG-полімерази (RAG1 і RAG2) (RAG - ген, який активує рекомбінацію).

Таким чином, вплив IL-2 і -4 на B1-клітини повинно викликати рекомбінацію V-генів імуноглобулінів. Раніше було показано, що STAT6 і NF-kB асоційовані з індукцією ряду генів [13-15] і між цими факторами транскрипції існує взаємодія [16]. Синергетичний ефект STAT6 і NF-kB, мабуть, лежить в основі зв'язку між розпізнаванням IL-4 і CD40 і індукцією експресії гена AID [17].

Ще один фактор, який був виявлений в результаті біоінформаційного аналізу, - рецептор CD40. Останній при взаємодії з CD40L (CD154) здатний викликати активацію і проліферацію B-клітин. Слід зазначити, що ліганд CD40 - CD40L є характерним маркером для CD4 + -Т-клітин і нетиповим - для гамма-дельта-Т-клітин. Однак в літературі згадується про CD4 + гамма--дельта-Т-лімфоцитах [18] і про експресії CD40L на активованих гамма-дельта-Т-лімфоцитах [19].

Гамма-дельта-Т-клітини можуть виступати як АПК для CD4 + -T-лімфоцитів [20], що дозволяє припустити непряме їх вплив на імунну відповідь.

У міру старіння B1-клітини миші перестають експресувати в великих кількостях костімулірующую молекулу CD86 і стають потужними активаторами CD8 + -T-клітин [21], а так як частина гамма-дельта-Т-лімфоцитів в кишечнику є CD8 +, не можна виключати можливість прямого взаємодії B1 клітин з гамма-дельта-Т-клітинами (рис. 2).

У різних джерелах зустрічаються дані про те, що В1-клітини можуть бути і ТЗ. B B1-клітинах відсутні суттєві дефекти, які не дозволяли б відповідати на Т-клітинні стимули, включаючи CD40L, IL-4 і -5 [22]. IL-5 також здатний стимулювати проліферацію B1-клітин за відсутності CD40 - CD40L взаємодії [23].

Спираючись на аналіз літератури та результати, отримані з використанням біоінформаційного аналізу, можна припустити, що подібна взаємодія між В1- і гамма-дельта-Т-клітинами можливо.

Встановлено, що регуляція на рівні miRNA і ін. Критична для розвитку і нормального функціонування імунної системи. Пізніше було виявлено ряд miRNA, які можуть брати участь на різних стадіях гемопоезу [24] і робити внесок в остаточну диференціювання дорослих лімфоцитів [25].

У більшості випадків miRNA виступають в ролі інгібіторів внутрішньоклітинних процесів. Так, проведений нами аналіз дозволив отримати дані про вплив miRNA155 і miRNA146a на AID, що приводить до її пригнічення як безпосередньо, так і опосередковано через придушення NF-kB [26]. Рецептор Notch, який регулює клітинну диференціацію, є типовою мішенню для miRNA326 [27]. У диференціації B-клітин важливу роль відіграє miRNA181A [27].

Використовуваний нами метод дозволив проаналізувати кілька видів miRNA, а також встановити можливі точки їх впливу на основні внутрішньоклітинні процеси.

Оцінка вкладу деяких miRNA в ці процеси може служити альтернативним підходом для аналізу взаємодії B1- і гамма-дельта-Т-лімфоцитів.

Дане наукове напрямок представляє інтерес не тільки в галузі фундаментальної імунології. Відомо, що B1- і гамма-дельта-Т-клітини беруть участь в розвитку ряду захворювань. Так, В1-лімфоцити задіяні в розвитку Th2-опосередкованого коліту [28], а гамма-дельта-Т-клітини можуть грати протективногороль для епітеліальних клітин і сприяти розвитку запальних процесів [29]. Дослідження механізмів активації або супресії запалення в кишечнику дозволить в перспективі виявити мішені для терапевтичного впливу і реалізувати персоналізований підхід.

Отримані в дослідженні дані свідчать, що B1- і гамма-дельта-Т-клітини можуть виступати в якості нових терапевтичних мішеней.

Терапія багатьох захворювань (зокрема, запальних і інфекційних) тісно пов'язана з молекулярними технологіями. Підходи до miRNA-опосередкованої регуляції активності клітин займають в ній не останнє місце. Вони потенційно можуть бути використані для регуляції запальних процесів в кишечнику.

Однак залишається ряд питань: створення комплексного препарату або монопрепаратов, які будуть міняти ряд клітин або будуть спрямовані тільки на певний ефект, а також доставку нуклеїнових кислот (регуляторних РНК).

висновок

Біоінформаційний підхід, який використовується нами для прогнозування шляхів взаємодії B1- і гамма-дельта-Т-лімфоцитів, дозволив визначити найбільш ймовірні з них і основні сигнальні каскади, які беруть участь в такій взаємодії. Крім того, метод дав можливість спрогнозувати участь деяких видів miRNA в цих процесах.

Подальше вивчення зв'язку між B1- і гамма-дельта-Т-лімфоцитами дозволить по-новому поглянути на патогенез ряду захворювань, в яких беруть участь субпопуляції цих клітин.