Капілярний секвенування, як воно є

Сайт Наука в Сибіру 11 квітня 2018 р
Сайт Новини Сибірської Науки 12 квітня 2018 р
Газета Наука в Сибіру №18 (3129) від 17 травня 2018 р

Слова "ген" і "ДНК" чули, напевно, все, словосполучення "прочитати геном" - майже всі. Але як технічно розшифровується інформація, захована в ДНК? Хто володіє "генетичної азбукою морзе" і що виконує роль телеграфного ключа? Щоб відповісти на це питання, журналістка "Науки в Сибіру" взяла участь в першій науково-практичній школі по капілярному секвенированию ДНК, організованої Інститутом молекулярної і клітинної біології СО РАН, компаніями "Хелікон" і "Thermo Fisher Scientific".

У наш час секвенування - тобто прочитання послідовності нуклеотидів (елементарних цеглинок) ДНК і РНК - рутинний процес, необхідний для роботи більшості біологічних лабораторій.

- Капілярна секвенування (ще його називають секвенуванням по Сенгер) - один з найбільш широко використовуваних методів розшифровки послідовності ДНК в лабораторіях. Він застосовується, в тих випадках, коли людині потрібно проаналізувати окремі молекули ДНК, найчастіше в генної інженерії або в ході медичних досліджень. Наприклад, при створенні генно-інженерних конструкцій досліднику важливо упевнитися, що в створеній ним штучної молекулі ДНК все працює саме так, як він припускає. У медицині метод застосовується при пошуку якихось конкретних мутацій у пацієнтів, щоб переконатися: діагноз поставлений правильно. Відповідно, беруть зразок тканини або фізіологічної рідини цього пацієнта, виділяють ДНК і прочитують цікаві для них місця в геномі, - пояснив заступник директора Інституту молекулярної і клітинної біології СО РАН, завідувач лабораторією геноміки ІМКБ СО РАН кандидат біологічних наук Степан Белякін.

На школу приїхало 15 чоловік з Інститутів СО РАН, НГУ, наукових організацій Кемерово, Красноярська, Томська.

- Ми організували цей захід, в основному, щоб поділитися нашими досвідом, показати, які проблеми виникають при капілярному секвенування і як їх вирішувати. Я припускав, що прийдуть переважно люди з сусідніх інститутів, можливо потенційні замовники Центру колективного користування ІМКБ СО РАН. Однак завдяки активності компанії "Хелікон", яка виступила співорганізатором школи, приїхали люди ще з інших міст. Оскільки у нас великий досвід використання методу секвенування по Сенгер, ми, напевно, можемо стверджувати, що з основними проблемами вже встигли зіткнутися і якось їх або вирішити, чи розвести руками. Цьому і були присвячені лекції співробітників нашого інституту, а дві доповіді представників компанії Thermo Fisher Scientific: зачіпали стандартні речі - пристрій секвенатор, його налаштування і використання, пробопідготовку, - додав Степан Белякін.

При секвенування по Сенгер фрагмент ДНК, який потрібно прочитати, спочатку впроваджується в плазміду (кільцева ДНК у бактерій), потім бактерії, розмножуючись, "штампують" безліч копій вихідного фрагмента, після чого багаторазово скопійовані ділянки ДНК виділяють з мікроорганізмів і додають в суміш для секвеніруют реакції. А вже в цій суміші починається найцікавіше - вихідний фрагмент знову багато разів тиражується, але вже не повністю, а "обривками", довжина яких може різнитися, як мінімум, на один нуклеотид. Множити фрагмент допомагає ДНК-полімераза, синтез починається з "затравки" - праймера, а "обриває" шматочки ДНК термінатор - нуклеотид, що володіє властивістю припиняти синтез ланцюга ДНК. Кожен термінатор несе на собі флуоресцентну мітку, яка дозволяє однозначно визначити його "ім'я" - A (аденін), T (тимін), G (гуанін) або C (цитозин).

Щоб нарешті прочитати нуклеотидную послідовність вихідного фрагмента, "уривки" ДНК диференціюються по довжині за допомогою електрофорезу - переміщення частинок в гелі під дією електричного поля. Коли на негативно заряджену молекулу ДНК діє електричне поле, вона рухається по капіляри секвенатор, заповненому гелем, до позитивного полюса.

Капіляри є тонкі трубочки, діаметр яких менше перетину людської волосини, вони складаються з надчистого кремнію і оточені металевою оболонкою. Відомо, що в щільному гелі короткі "шматочки" ДНК "проходять" швидше, ніж довгі. Відповідно, їх можна ранжувати за довжиною, а роздільна здатність дорівнює одному нуклеотиду.

Коли "шматочки" ДНК "добігають" до позитивного полюса капіляра, на фотографічній матриці секвенатор визначається колір нуклеотиду-термінатора по його флуоресцентної мітці. Таким чином, можна визначити послідовність нуклеотидів вихідного фрагмента - наприклад, якщо короткий шматочок ДНК з двох нуклеотидів маркований літерою Т, то значить на другому місці послідовності ДНК теж варто нуклеотид тимін і так далі.

Учасникам школи треба було самим приготувати реакційну суміш (фрагмент ДНК для прочитання послідовності було надано вже готовий), провести секвеніруют реакцію в ампліфікаторі - приладі, який багаторазово (протягом 35 циклів) нагріває і охолоджує суміш протягом двох годин для того, щоб в ній сталося освіту "обривочков" ДНК, а потім очистити продукти реакції і завантажити їх в секвенатор.

На погляд недосвідченого людини, найскладніше в приготуванні реакційної суміші - правильно користуватися автоматичною піпеткою. Оскільки компоненти вимірювалися в мікролітрів, (1 мкл - 1/1000 мілілітра), дуже складно було помітити, набраний чи необхідний реагент, на око це визначити практично неможливо.

Потім, після двогодинного циклічного нагрівання суміші в ампліфікаторі, проводилася очистка продуктів реакції від невідпрацьований праймерів. Після чого учасники познайомилися з восьмиканальним (восьмікаппілярним) секвенатор, продуктивність якого - до 1000 пар нуклеотидів за один цикл роботи приладу, а завантажити одноразово можна вісім зразків. На аналогічних машинах був вперше, протягом 13 років, прочитаний геном людини. Зараз, звичайно, розшифровка таких великих обсягів інформації проводиться методом повногеномне секвенування, а не капілярного.

Треба відзначити, перші секвенатори були не тільки громіздкі і повільні, але і навіть небезпечні для здоров'я - термінатори позначалися НЕ флуоресцентної, а радіоактивною міткою. Сучасний же прилад займає не більше місця, ніж середніх розмірів копіювальний апарат. Більш того, всю роботу по визначенню послідовності нуклеотидів, секвенатор виконує сам і як результат вивантажує послідовність ДНК і таблицю з графіками, схожими на кардіограми - на ній візуалізовані кольором різні нуклеотиди, а кожна буква ( "ім'я" нуклеотиду) виглядає на графіку, як пік. Після отримання результату учасникам школи треба було оцінити якість послідовності по інтенсивності піків і іншим параметрам.

На жаль, відсутність навичок роботи з автоматичною піпеткою не минуло дарма - кореспонденту "Науки в Сибіру" "прочитати" ДНК не вдалося. Зате у всіх інших учасників вийшло відмінно. Завершилася школа оглядом безкоштовного програмного забезпечення для аналізу даних і сучасних рішень для секвенування.

Надія Дмитрієва
фото автора

PDF-файл статті