Елементарно, Ватсон. Для чого використовується генетична експертиза, як її проводять, і чи потрібно її робити кожному - Проект Fleming

Людині властиво прагнення дізнатися, звідки він стався і як він "вийшов". Цим прагненням можна пояснити любов багатьох людей до дослідження власного генеалогічного древа, бажання дізнатися, яким же був найперший людина, той самий, який походить від мавпи, а також бажання дізнатися, що ж закодовано в його власній ланцюжку ДНК. Звідси все це безліч статей про те, що людина на 98% - шимпанзе, а на 50% - банан (насправді це не зовсім так).

Джерело: LookAtMe.ru

Підготовча робота

Розвиток біологічної і медичної наук дозволило людині в буквальному сенсі зрозуміти, що ж записано в ДНК і за що відповідають конкретні її ділянки. Масової розшифровкою генома займалося багато вчених, масштабні дослідження почалися ще в 1990 році зі стартом проекту "Геном людини". Незважаючи на те, що повністю геном був начебто розшифрований до 2003 року, додатковий уточнююче аналіз деяких ділянок проводиться донині. Варто зазначити, що послідовність ДНК кожного окремо взятого неклонованої організму унікальна, тому до цілей проекту можна віднести визначення послідовності всього ланцюжка ДНК. Що дійсно намагаються виявити вчені, так це схожі ділянки геному, а також однонуклеотидний поліморфізм, коли порівнювані послідовності відрізняються на один нуклеотид. Такі відмінності можуть відповідати за прояв різних алелей гена, що визначають варіанти розвитку ознаки.

Розшифровка геному стала можливою завдяки розвитку різних видів виділення ДНК з біоматеріалу, секвенування, а також завдяки успіхам дослідників в галузі біоінформатики. На цей момент існує безліч методів вивчення ДНК, проте і в цій, здавалося б, уже досить дослідженою області, прогрес все ще рухається семимильними кроками. І ось ми вже можемо похвалитися методами секвенування нового покоління (Next-Generation Sequencing, NGS), які дозволяють визначати послідовність нуклеотидів набагато ефективніше і дешевше. Перспективи це відкриває колосальні, адже нові секвенатори працюють всі швидше, а ціни на використання технології стають все нижче. Це дозволяє використовувати NGS, наприклад, в онкологічних дослідженнях для більш глибокого і точного розуміння молекулярних основ розвитку окремих пухлин.

Термінологія

Звичайно ж, подібний прогрес не може не зацікавити медиків і криміналістів. Що ж ми зазвичай розуміємо під терміном "генетична експертиза"? Як показує практика, люди, які не є експертами, сприймають це словосполучення по-різному: дехто вважає, що подібним займаються криміналісти; інші ж вважають, що генетична експертиза дозволить їм дізнатися, ризик розвитку яких захворювань у них вище стандартного популяційного. Треба сказати, що частково мають рацію і ті, і інші, але перші, мабуть, будуть праві дещо частіше. Однак по суті криміналісти займаються застосуванням методів генетичного аналізу в своїй області, а термін "генетична експертиза" може бути узагальнюючим і включати в себе також поняття скринінгових тестів. В англійській мові все трохи простіше: для судово-медичної експертизи використовується термін DNA profiling (аналог в російській - генетична дактилоскопія), для аналізу родоводів і генетичної діагностики використовуються терміни genetic / DNA testing, genetic ancestry testing.

генетичний відбиток

Дослідження своєрідного генетичного відбитку індивідуума (за аналогією з відбитком пальця), який залишається незмінним протягом усього його життя, використовується криміналістами по всьому світу. Подібно до багатьох інших відкриттів, методика генетичної дактилоскопії була відкрита випадково, була "побічним продуктом" іншого дослідження. Офіційно датою відкриття технології є 10 вересня 1984 року, коли під час вивчення генетичних відхилень генетик Алек Джеффріс раптово помітив, що у різних людей послідовності ДНК відрізняються певним чином. Вченим було виявлено безліч повторюваних послідовностей ДНК, так званих мінісателітів, які сильно різнилися у різних людей. У криміналістиці методика була вперше застосована в 1986 році, коли експерти досліджували зразки сперми, зібрані на місцях двох злочинів, що сталися в 1983 і 1986 роках. Аналіз дав всі підстави не тільки зв'язати два злочини, а й реабілітувати невинну людину, а також справив фурор в галузі криміналістики.

Професор сер Алек Джеффріс

Після цього подібний скринінг почав повально проводитися по всьому світу. Технологія дозволяє ідентифікувати людину по волоссю, краплі крові, слині та інших видів біоматеріалу, навіть якщо його дуже мало. Справді, вченим потрібно всього лише близько 100 мікрограмів для того, щоб досліджувати зразок з місця злочину. Це настільки мало, що навіть кілька клітин може бути досить для проведення аналізу.

За допомогою технології генетичної дактилоскопії стали можливими встановлення батьківства, ідентифікація останків людей, а також виявлення схильності до різних форм раку. При цьому не слід плутати ДНК-дактилоскопію з розшифровкою генома, адже в першому випадку аналізуються тільки повторювані ділянки геному, які і є індивідуальними для кожної людини.

етапи дослідження

Першим і найважливішим етапом ДНК-дактилоскопії є виділення зразка ДНК. Сучасні технології можуть дозволити виділити її мало не з будь-якого предмета, з яким контактував людина, проте успіх даного етапу залежить від безлічі факторів. Найбільш бажаними предметами дослідження є нігті, недопалки, жуйка, зубна щітка, зразки сперми на будь-яких поверхнях і тканинах, використані презервативи, тканина з краплями крові, волосся з корінням.

Виділити ДНК, взагалі кажучи, не так вже й складно, як здається. Більш того, кожен з вас здатний зробити це в домашніх умовах, достатньо лише вбити в Гугл "як виділити ДНК зі слини". Однак для проведення лабораторних досліджень необхідно, щоб ДНК була не тільки виділена, але і очищена від різних речовин, які можуть до неї "прилипнути".

Комплект для дослідження ДНК, виділеної з слини

Як правило, методики виділення ДНК з біоматеріалу можна розділити на дві групи: методи з високою ефективністю екстракції і експрес-методи. У першому випадку процес часто триває в рази довше, ніж у другому, так як методи з високою ефективністю екстракції включають в себе кілька етапів: розчинення матеріалу, видалення інгібіторів ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції, за допомогою якої проводиться дослідження), відмивання нуклеїнових кислот. Дані методи широко використовуються в тих випадках, коли висока ступінь очищення ДНК є пріоритетною. Експрес-методи базуються на термічній обробці біоматеріалу, і їх істотною перевагою є простота виконання маніпуляцій. Цей фактор є перевагою в тих випадках, коли обробці підлягає відразу велику кількість зразків, однак застосування даних методів обмежує низька ефективність екстракції ДНК.

Схема ампліфікації, або збільшення, кількості копій ділянки ДНК

Наступним етапом після виділення ДНК стає проведення ПЛР, яка дозволяє зробити мільйони копій однієї ділянки ДНК, необхідних, зокрема, для дослідження в криміналістичній практиці коротких, або тандемних, повторів (Short Tandem Repeats, STRs), які можуть складатися всього з 4-5 нуклеотидів і повторюватися кілька разів поспіль. В ході ПЛР до всіх копій STR прикріплюються флуоресцентні барвники, окремі для кожного тандемного ділянки, так що всі копії ДНК конкретної ділянки можна буде відрізнити від інших в суміші. Потім розчини досліджуються за допомогою гель-електрофорезу: по двох краях лунок в особливому гелі, в які заливаються розчини з ДНК, створюється електричне поле. Так як сахарофосфатнимі ділянки ДНК заряджені негативно, молекули в гелі рухаються від негативно зарядженого краю до позитивно зарядженого. В результаті більш короткі фрагменти сильніше розганяються і проходять більшу відстань в гелі. Таким чином можна обчислити довжину кожної ділянки.

Схема проведення гель-електрофорезу

Для того, щоб підтвердити провину підозрюваного, його або її STR-ділянки повинні відповідати STR-ділянкам зразків, знайдених на місці злочину. Згідно з даними ФБР, коли всі вони ідеально відповідають один одному, слідчий практично гарантовано зірвав куш і обчислив злочинця. Шанси звинуватити невинного складають приблизно 1: 1000000000. Однак навіть одна невідповідність між тандемними ділянками може бути достатнім для того, щоб виправдати підозрюваного або продовжити дослідження. Так губернатор Іллінойсу Джордж Райан в кінці 1990-х ввів практику тестування ДНК в'язнів-смертників. Згідно з результатами 13 з 25 протестованих можна було звільнити від відповідальності. Губернатор негайно наклав мораторій на виконання смертних вироків. Інший випадок стався в Техасі. У 1990 році Рой Крайнер був засуджений до 99 років позбавлення волі за згвалтування і вбивство 16-річної дівчини. Кілька років по тому він відправив зразки своєї ДНК на аналіз, результати якого виключали його участь у злочині. Суди, однак, не були так впевнені, що експертиза є більш вагомим доказом, ніж свідчення свідків. Знадобилося додаткове розслідування, щоб нарешті в 2000 році з Роя зняли всі звинувачення.

Від злочинів до медицини

Генетична діагностика - одна з новітніх галузей медицини, яка використовує молекулярно-генетичні методи для виявлення схильності до тих чи інших хвороб, вибору профілактики і лікування захворювання. Для діагностики в даному випадку можуть використовуватися зразки не тільки ДНК, але і РНК, а також білків, наприклад, гемоглобіну, проте найбільш поширеним є все ж дослідження ДНК. Певну складність представляють собою полігенні хвороби, чий розвиток обумовлюється безліччю генів і їх можливим взаємодією, так як в даному випадку спадковість є не стільки очевидною. Для ведення пацієнтів з деякими захворюваннями роль генетичної діагностики грає найважливішу роль, наприклад, пацієнтів з гемохроматозом, спадковим порушенням обміну заліза в організмі. Однак при таких захворюваннях, як хвороба Альцгеймера, ДНК-діагностика буде фактично марною, так як ефективного лікування поки що не існує.

Найчастіше подібна практика не тільки корисна вченим для дослідження, але і може значно полегшити життя пацієнта, так як дозволяє виявити такі спадкові захворювання, як фенілкетонурія (спадкове захворювання, пов'язане з порушенням метаболізму амінокислоти фенілаланіну), яка вимагає негайного лікування.

Однак слід чітко розмежовувати схильність до захворювання і його бессимптомную стадію, що досить складно зробити на даному етапі. Так, наприклад, досить складно визначити, чи є мутація певного гена маркером схильності до сімейного раку молочної залози або маркером безсимптомної стадії захворювання. Також слід зазначити, що для здорової людини без сімейної історії генетичного захворювання тест, швидше за все, не буде настільки корисним, про що заздалегідь вас можуть попередити консультанти.

Класифікація

Існує кілька видів генетичного тестування. Молекулярно-генетичні тести досліджують окремі гени або короткі відрізки ДНК для ідентифікації мутацій або варіантів гена, які можуть привести до генетичного захворювання. Хромосомні тести аналізують цілі хромосоми, і використовуються для виявлення синдромів, пов'язаних зі значними генетичними змінами, наприклад, з наявністю додаткової хромосоми. Біохімічні тести вивчають кількість або рівень активності білків, аномалії цих показників можуть вказувати на зміни в ДНК.

Тестування також можуть бути класифіковані за програмними цілями виконання. Так скринінг новонароджених, як зрозуміло з назви, використовується для виявлення генетичних захворювань відразу після народження. В даний час скринінг такого захворювання, як фенілкетонурія, рекомендується проводити на всіх новонароджених не пізніше 4-5 дня його життя. Тест виконується на зразку крові, взятої з п'яти. При такій діагностиці патологічних змін (наприклад, втрати інтелекту аж до ідіотії) можна уникнути за допомогою коректування дієти, яка буде обмежувати надходження фенілаланіну з їжею.

Підготовка до забору зразків крові у новонародженого

Тестування на носійство використовується для ідентифікації людей, в чиєму коді міститься одна копія мутантного гена, який може проявитися в майбутньому поколінні в разі, якщо нащадкам не пощастить і з другої копією. Такий тип тестування фахівці пропонують пройти людям, які мають сімейну історію генетичних розладів, а також представникам деяких етнічних груп. Так, наприклад, муковісцидоз частіше зустрічається у білого населення і євреїв-ашкеназі. Часто такі тести радять проводити в процесі планування вагітності, так як тестування обох батьків може дати повну інформацію про ймовірність успадкування захворювання нащадку.

Якщо жінка вже вагітна і хоче перевірити плід на генетичне захворювання, то їй прийде на допомогу пренатальна діагностика. Вона використовується для виявлення змін в генах або хромосомах плоду перед народженням. Цей тип тестування передбачає, що існує підвищений ризик того, що дитина буде мати якісь розлади, однак він не може визначити всі можливі вади розвитку. Слід зазначити, що деякі методи пренатальної діагностики є інвазивними, наприклад, амніоцентез, або аналіз навколоплідних вод. З цього випливає, що вони мають, як мінімум, протипоказання, як максимум - серйозні ускладнення аж до інфікування і передчасного вилиття вод.

З розвитком технології екстракорпорального запліднення також розвинулися і методи дослідження генетичних змін у ембріонів, які ще не імплантування в матку. Для проведення тестування використовується невелика кількість ембріонів і тільки ті з них, у яких не знайдено генетичних відхилень, імплантують в матку.

Діагностичні та прогностичні тести використовують для ідентифікації або виключення одного або декількох певних станів. Діагностичне тестування може бути виконано пренатально і постнатально, але не для всіх генів. Прогностичне може виявити мутації, які збільшують ризик розвитку у людини деяких захворювань, наприклад, деяких видів раку або спадкового гемохроматозу.

Схема успадкування муковісцидозу від батьків-носіїв

ДНК-діагностика проводиться за допомогою прямих методів (виявляються певні мутації певних генів) тільки в тих випадках, коли точно відомий ген, який відповідальний за розвиток захворювання або синдрому, а також відомі всі типи його патологічних мутацій. Для захворювання можуть існувати так звані "мажорні" мутації, тобто ті, які зустрічаються найбільш часто. Наприклад, для того ж муковісцидозу такою мутацією є del F508, тобто делеция трьох нуклеотидів гена CFTR на хромосомі 7, яка в кінцевому підсумку призводить до втрати одного кодону для фенілаланіну; для хореї Гентингтона такою мутацією стає збільшення кількості CAG-повторів. Головною перевагою прямих методів є неймовірно висока точність діагностики і відсутність необхідності аналізування всіх членів сім'ї. Основним недоліком є ​​той факт, що для його застосування потрібно знання точної локалізації гена в геномі і його варіацій.

Непрямі методи використовують тоді, коли мутантний ген точно не визначений, але відомо, що він знаходиться на конкретній хромосомі. Також ці методи застосовують тоді, коли прямі не дають результату. Маркерами для непрямої діагностики є точкові заміни, делеції, повтори. Найбільш зручними для дослідження є мікро- і мінісателлітние поліморфні маркери. Однак суттєвим недоліком методів є відсутність стовідсоткової точності. При цьому від дослідника не потрібно точне знання структури гена і його спектра мутацій, оскільки завжди є можливість використання маркерів. Природно, найкращим варіантом буде використання комплексної ДНК-діагностики, що поєднує в собі прямі і непрямі підходи, таким чином можна буде підтвердити результати, отримані в ході аналізу, а результат буде більш точним.

Розташування генів BRCA1 і BRCA2 на хромосомах

У клінічній практиці генетичні тести також використовуються. Наприклад, для дослідження раку молочної залози ДНК можна виділити і з тканини, і з крові. Основні тести проводяться для виявлення мутацій в генах BRCA1 (хромосома 17) і BRCA2 (хромосома 13). Однойменні білкові продукти цих генів збираються в ракових клітинах молочної залози та інших тканинах, де вони допомагають відновлювати пошкоджені ДНК або руйнувати клітини в випадках, коли ДНК не може бути відновлена. Якщо ж ці гени є мутантними, репарація пошкодженої ДНК не відбувається належним чином, і ймовірність розвитку раку підвищується. Серед євреїв-ашкеназі кожен сотий є носієм мутації 185delAG гена BRCA1; у 1% популяції є мутація 6174delT гена BRCA2. Ще одним геном, досліджуваним в даному випадку, є ген TP53, мутації в якому виявляються в клітинах багатьох ракових пухлин. Всі три гена є генами-супрессорами пухлин, продукти яких повинні забезпечувати профілактику онкогенеза, проте мутації в них впливають на роботу білкового продукту.

***

Треба сказати, що будь-які генетичні дослідження - досить дороге задоволення, тому, можливо, вони не так сильно поширені. Для того, щоб заманити потенційних клієнтів, компанії йдуть на різні хитрощі, наприклад, обіцяють дати рекомендації по харчуванню та спорту і розповісти все про ваш характер. Природно, це все - маркетингові виверти, які не містять під собою сильної доказової бази. Винятками, звичайно, є випадки, коли при певному захворюванні необхідно дотримуватися дієти і вести активний спосіб життя, наприклад, при цукровому діабеті; в таких випадках подібні рекомендації виправдані і навіть необхідні.

Редакція висловлює подяку Аллі Шлейкіной, співробітнику лабораторії молекулярної біології НДІ онкологи імені Петрова, за допомогу в підготовці матеріалу

Если ви нашли помилки, відiлiть ее ведмедика та натісніть Ctrl + Enter