Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Схема робочого процесу список експериментальні кроки для ідентифікації передбачуваного метаболіт в секреції залози C. explodens показано на малюнку 13. Крім того Схематичний огляд найбільш важливих частин тіла COCY працівник мурах для представлених експерименту надається як додатковий S1 малюнок A, B. Основні кроки від розтину мурах до передбачуваного метаболіт ідентифікації в змісті MGR проілюстровані в Додатковий рисунок S2.

Щоб ізолювати MGR вміст підходить для volatilome аналізу, що охолоджується держава зберігався всього перевезення, зберігання, а також в процесі розтину. З цією метою мурахи були заморожені відразу ж після їх збору з використанням комах аспіратор (розділ 1 і Малюнок 1) в situ. Після зберігання протягом 2 днів в холодильнику-20 ° C мураха зразки були перевезені на сухий лід в Австрію, де вони були відразу ж поставили на-80 ° C до подальшого аналізу. Мурахи, підходить для бути обрані для ізоляції їх зміст MGR експонат Гастер регіону, який є кругла і недоторканими (малюнок 2A) і в кращому випадку, добре укомплектований з вмістом MGR, як зазначено в MGR видно між тергитов (рис. 2B). Малюнок 2 c, D показані gasters мурах, які не підходять для подальшого аналізу. Основні кроки (кроки 2,3-2,6 бере участь в процесі ізоляції вмісту MGR від мурах COCY) показано на малюнку 3. Ізольовані MGR вміст (жовтий в разі C. explodens, але кольори можуть варіюватися від білого до червоного кольору в інші види, що належать до групи COCY) показано на малюнку 14.

Коли розкривали мурах для їх зміст MGR, слід подбати не проколу або розриву інших залоз або кишечника (крок 2.5). На малюнку 4 показана Гастер розчленованих мураха, який як і раніше містить два інших, недоторканими залоз (ГД і VG) після ізоляції контенту MGR. Приклад видимі забруднення вміст кишечника ant показаний на малюнку 15. Оскільки не можна повністю уникнути перехресного забруднення з вмістом ГД, розташований під MGR, частиною протоколу зображений для аналізу цих залоз для порівняння результаті сигналів з сигнали від змісту екстракту MGR (розділ 6). Коли процедура диссекции правильно зроблено, це можна отримати близько 0,75-1,2 мг MGR змісту на мурашки. Для протоколу, описані тут MGR зміст п'яти мурах були об'єднані отримувати повторювані зразки 3,9-5,9 мг кожна.

Вміст ізольованого залози водосховища було витягнуто з EtOAc (розділ 3) і аналізуються ГХ-МС (розділ 4). Вимірювання вмісту мг екстракту C. explodens робочі мурахи призводить Хроматограмма, що складається з піків і масових спектри для десятки передбачуваних MGR вміст сполук (рис. 5). Два домінуючою метаболітів 1- (2,4,6-trihydroxyphenyl) -ethanone (ID 4) і 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) в мг зміст екстракт викликало стовпець перевантаження, саме тому того ж зразка була проаналізована знову на більш високому Спліт співвідношення прочитаних (Малюнок 5, інкрустація). Наприклад, можливе перехресне забруднення MGR змісту, складових ГД буде видна як додаткові піки в GC-MS Хроматограмма, експонується кінці РТС, починаючи від приблизно хвилину 29 (Малюнок 12). Виключаючи хроматографических піків і масових спектрів сполук також знайдені в розчинника бланк, що походять з стаціонарної фази GC шпальти чи вміст в мураха Гастер ГД і подальшої обробки з MetaboliteDetector програмне забезпечення в результаті близько 110 MGR вміст сполук з сигнал / шум співвідношення контрастності ≥ 10. Для більш пізніх метаболіт анотації та ідентифікації з програмним забезпеченням MetaboliteDetector хроматограми були відкалібровані і Рі значення були визначені для виміряних зразків файлів (крок 5.3 і суб кроки, Рис нок 7 Малюнок 6,, Малюнок 8, Малюнок 9). Виявлених передбачуваних MGR зміст метаболітів були Анотована, грунтуючись на комбінації спектра подібності в NIST-бібліотеку, яка утворена невід'ємною частиною програмного забезпечення MetaboliteDetector в представлених прикладом (крок 5.4 і суб кроки, Малюнок 10). Крім того, виявлені значення ри в літературі для ж або порівнянної стаціонарної фази, товщина плівки, діаметр колони GC були розглянуті і складові анотації (кроки 5.4.4 і 5.4.5). Після установки суворого відповідності критеріям і підтвердження RIs і масових спектри з використанням стандартів, як описано в розділі протокол для одного стандарту з'єднання (кроки 5.4.7-5.4.15 і Малюнок 11), можна було підтвердити особистість близько 10% від виявлених метаболітів. Так як докладний звіт про volatilome MGR зміст C. explodens будуть опубліковані в іншому місці, даний дослідження зосереджено на цих метаболітів, які вже були описані в попередньому виданні Jones et al. 17 (видів тут як KB02-108; див. Також готувати і ін. 23). в таблиці 1 дається огляд цих виявлених сполук.

Малюнок 1: схема, креслення комах Аспіратор. В кришку, що тюлені флаконі або контейнера робляться два отвори, де проходять два гнучких трубок. Відкриття однієї труби (T1), яка стикається з внутрішньої частини флакона запечатаний з сіткою досить тонкої блокувати комах. Крім того отвори зроблені в трубку для полегшення обміну повітря. Кінець трубки T2 тісно вказує на комах, які всмоктуються в пробірку вибірки, аспіраційних через T1. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: без змін у порівнянні з поламаною Гастер. (A) недоторканими Гастер підходить для розтину. Недоторканими Гастер (B) майже повністю заповнені з вмістом MGR, підходить також для розтину. (C) і (D) зламаною мураха gasters з вмістом MGR викидається і загартовані (жовтий), можливо зламаною під час розрив покривів Гастер під час вибірки. Ці мурахи виключені з розсічення, вилучення і подальшого аналізу. T: хвостику. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: основні етапи в процесі диссекции. (A) поділ Гастер регіону від решти частини тіла мурахи. (B) отшелушивающим екзоскелет: хвостику 1, хвостику 2 (C) і хвостику 3, після чого вміст парних жовтого кольору МІПРО майже повністю видна (D). (E) видалення липке змісту MGR за допомогою голки розсічення. T: хвостику. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: мураха Гастер після ізоляції вмісту MGR. Два інших залоз присутня в Гастер (VG: отрута залоз і DG: Dufour залози) можна побачити. Після видалення вмісту MGR (лівий кадр після ізоляції можна побачити в жовтий) обидва відділення і раніше має бути недоторканими. Ці залози можуть бути проаналізовані в так само, як вміст MGR. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 5: представник всього Іон поточного (TIC) Хроматограмма змісту екстракту MGR. Два найбільш поширених GC-MS піків призвело до більш симетричною форми хроматографических піків, коли більш високий коефіцієнт поділу (50: 1) був обраний замість регулярних співвідношення 2: 1 (див. Вставку). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 6: визначення першої виявлення алканів в Рі calibrant хроматограми. Трикутник під пік максимуму перший пік алканів обраний. Алкана elutes в 6.31 хв і показує високий спектр схожість (тут, спец сім.) Бібліотека запис «Alkane_C09». Для підтвердження особи алканів, масові спектр порівнюється з бібліотекою (наприклад, NIST хімії WebBook22). У прикладі представлені Нонан ідентифікується по його Молекулярний іон з m / z значення 128. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 7: ри калібрування з використанням стандартного суміш n алканів. РІ calibrant, який був відкритий файл даних і використовувати функцію «Рі-калібрування-майстер». Правильний підбір час утримування для Рі, зображені в таблиці калібрування повинні бути перевірені. RT 6.31 хв для alkane_C09 (Нонан) правильно відображаються в таблиці. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 8: неправильно РТС відображаються в таблиці калібрування. RTs не відображаються правильно (або показано неправильне значення RT або відсутнє значення RT відображається як -1). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 9: ручна корекція неправильно РТС в таблиці калібрування. Помилкові значення можуть виправлятися вручну, додавши правильний RT для відповідних алканів, як показано тут, для Alkane_C39. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 10: порівняння масових спектр вибраного з'єднання NIST-Бібліотека записів. Після вибору, Пік максимального елюіруются 6,16 хв (ри 891) і активація функції «NIST-Пошук» (червоний гурток), відображається спектра схожість 0.99 для 2-heptanone. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 11: метаболіт ідентифікації контенту екстракт MGR. Масові спектр і Рі, що походять з складових елюіруются на 891 ри в Хроматограмма зразка порівнюються з внутрішньої бібліотеки записів, що містять RIs і спектрів виміряних стандартних з'єднань. Якщо «загальний показник подібності» (OSS, скорочено метаболіт детектор «Загальна simil.» Здійснення масових спектр і РІ) між з'єднання в бібліотеці готелю і комплексу в зразку файлу ≥ 0.9, з'єднання позначається як «визначені». Тут OSS між внутрішньою бібліотеки вхід 2-heptanone і складові елюіруются на ри 891 - 0,96, який призводить до ідентифікації 2-heptanone в MGR зміст екстракту. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 12: накладення TIC Хроматограмма секцій (хв 29 хв 35) DG змісту екстракту (червоний) і зміст MGR екстракт (синій). Пік області, відповідні перекриття (передбачуваний) з'єднань вище в ГД, зміст, ніж в змісті MGR екстракт; Ці сполуки потенційно відбуваються з ГД і тому розглядаються як екстракт (незначні) забруднюючих речовин в змісті MGR. У разі вмісту екстракт MGR C. explodens хроматографических піків, виникаючи від передбачуваного забруднення ГД можна знайти в приблизно хв 29, і ця частина Хроматограмма можуть бути виключені з подальшого аналізу змісту MGR. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 13: схема робочого процесу від зразків мураха метаболіт анотації / ідентифікації в залозі водосховище зміст витримки після аналізу GC-MS. Протоколу, представлені тут пояснює все експериментальні кроки, починаючи від ізоляції MGR вмісту через розсічення мураха і GC-MS аналізу і оцінки даних (вказується в чорному). В якості альтернативи комаха секреції також може бути створений і зібраних в situ (вказано в сірий колір). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 14: ізольовані воскової MGR вміст до вилучення. (A) вміст двох МІПРО триматися разом, але (B) вони також можуть бути розділені після ізоляції. У C. explodens колір вмісту MGR оранжево жовто, але може варіюватися від білого до червоного кольору в інших видів групи COCY. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 15: Ілюстрація ізольованою MGR секреції, крос забруднених складових комах кишечника (коричневий). Ці типи MGR ізолятів виключені з подальшого аналізу та робити виписки. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

1 Heptan-2-1 InChI = 1S / C7H14O / c1-3-4-5-6-7 (2) 8 / h3 - 6H 2, 1-2H 3 C7H14O 2 n ундекан InChI = 1S / C11H24 / c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2 / ​​h3-11H2,1-2H3 C11H24 3 n-Heptadecane InChI = 1S / C17H36 / c1-3-5 -7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2 / ​​h3-17H2,1-2H3 C17H36 4 1- (2,4,6-Trihydroxyphenyl) - ethanone Monoacetylphloroglucinol InChI = 1S / C8H8O4 / c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12 / h2-3,10-12H, 1H 3 C8H8O4 5 5,7- Dihydroxy-2-methylchromen-4-One Noreugenin InChI = 1S / C10H8O4 / c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5 / h2- 4,11, 13H, 1H 3 C10H8O4

Таблиця 1: метаболітів, визначених у EtOAc витягти вміст MGR, ізольований від C. explodens невеликі робочі мурахи. Представлені окремі метаболітів.

Додаткова цифра S1. У цьому рукописі представлений огляд найбільш важливих частин тіла, що належать до COCY мурахи (неповнолітніх трудящих). (A) MGRs показаними жовтим. Їх gastral частина використовується для volatilome аналізу. (B) gastral частина МІПРО розташований під тергитов 1-3. T: хвостику. Будь ласка, натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Додаткова цифра S2. Схематичний огляд представлених експерименту. Наводяться основні кроки від розтину мураха до передбачуваного ідентифікації в MGR зміст метаболітів. Будь ласка, натисніть тут, щоб завантажити цей файл.