ХАРАКТЕРИСТИКА КЛІТИННОЇ зважити, виділених з незміненої шкіри ЯКІ ПОСТРАЖДАЛИ З ОПІКОВОЇ ТРАВМОЮ

1. бібліографічна посилання

1 Алейник Д.Я. 1 Чарикова І.М. 1 Давиденко Д.В. 1 Рубцова Ю.П. 1

1 ФГБУ «Приволзький федеральний медичний дослідний центр» МОЗ Росії

Проблема відновлення дефектів шкіри після опікової травми за допомогою аутологичного клітинного матеріалу - один з перспективних напрямків сучасної регенеративної медицини. Представлені результати дослідження клітинного матеріалу, виділеного з біоптатів незміненій шкіри пацієнтів різного віку з опікової травмою. Клітинну суспензію отримували методами теплової та холодової ферментативної обробки, після якої визначали концентрацію і життєздатність клітин. Імунофенотип клітин суспензії визначали на проточної цитофлюориметрії Navios Becman Coulter. Частина клітин культивували по стандартному протоколу. Зростання культури контролювали кожні 24 години до формування субконфлюентного моношару (70-80%), який фіксували через 96-144 години. Після чого проводили гистохимическое дослідження, використовуючи антитіла до поверхневого антигену фібробластів людини - віментин і маркера клітин епідермісу - цитокератину. У суспензії свежевиделенних клітин були представлені і кератиноцити, і фібробласти. Клітини зберігали життєздатність і функціональну активність, так як фіксувалася їх виражена адгезія до пластику, здатність до проліферації і експресії типових маркерів. Характеристики клітин суспензії не залежали від віку постраждалих. Отримано клітинний матеріал хорошої якості, що відкриває перспективи для його клінічного застосування.

альбумін

еритроцити

опіки

вільнорадикальне окислення

перекисне окислення ліпідів

мікроциркуляція

1. Алейник Д.Я., Докукина Л.Н., Квіцинський Н.А., Чарикова І.М., Рубцова Ю.П., Воловик М.Г. Застосування свіжозаготовлених аутологічних клітин в практиці дитячої комбустіології // Російський вісник дитячої хірургії, анестезіології та реаніматології. - 2015. - Т. 5, № 4. - С. 18-23.

2. Карякін М.М., Докукина Л.Н., Алейник Д.Я., Аминев В.А., Квіцинський Н.А., Соколов Р.А. Спосіб лікування глибоких опіків на ранніх етапах: Патент України № 2499603. 2013. Бюл. № 3.

3. Королева Т.А., Будкевич Л.І., Шурова Л.В., Долотова Д.Д. Оцінка ефективності застосування сучасних еквівалентів шкіри в лікуванні дітей з глибокими опіками // Російський вісник дитячої хірургії, анестезіології та реаніматології. - 2014. - Т. 4, № 3. - С.77-84.

4. Фрейшене Р.Я. Культура тварин клітин. Практичний посібник. - М., БИНОМ. - 2010. - С. 691.

5. A comparative study of spray keratinocytes and autologous meshed split-thickness skin graft in the treatment of acute burn injuries / R. Sood, DE Roggy, MJ Zieger, M. Nazim, BC Hartman, JT Gibbs // Wounds. - 2015. - Vol. 27, N 2. - P. 31-40.

6. A randomized trial comparing ReCell system of epidermal cells delivery versus classic skin grafts for the treatment of deep partial thickness burns / G. Gravante, MC Di Fede, A. Araco, M. Grimaldi, B. De Angelis, A. Arpino, V. Cervelli, A. Montone // Burns. - 2007. - Vol. 33, N 8. - P. 966- 972.

7. Barret JP, Wolf SE, Desai MH, Herndon DN Cost-efficacy of cultured epidermal autografts in massive pediatric burns // Ann Surg. - 2000. - Vol. 231. - N 6. - P. 869-876.

8. The use of a non-cultured autologous cell suspension and Integra dermal regeneration template to repair full-thickness skin wounds in a porcine model: a one-step process / FM Wood., ML Stoner, BV Fowler, MW Fear // Burns . - 2007. - Vol. 33, N 6. - P. 693-70.

9. Wood FM, Kolybaba ML, Allen P. The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn injuries: a critical review of the literature // Burns. - 2006. - Vol. 32, N 4. - P. 395-401.

Відновлення уражень шкіри при опіках і ранах продовжує залишатися серйозною і соціально значущою проблемою. Одним із сучасних напрямків лікування дефектів шкіри є використання клітинних технологій [7; 9], зокрема - застосування персоніфікованих маломаніпуляціонних технологій. Основні переваги цих методів - використання аутологичного клітинного матеріалу і виключення етапів культивування, що забезпечує їх максимальну простоту і безпеку. Найбільш відома і отримала визнання маломаніпуляціонная технологія для лікування дефектів шкіри - технологія «ReCell» компанії Avita Medica, що застосовується в ряді країн Європи, Канаді та Австралії [5; 6; 8]. ReCell отримала реєстрацію і в Росії і використовувалася в ряді провідних опікових центрів [3], в тому числі в ФГБУ «ПФМІЦ» МОЗ Росії в 2013-2014 роках. Показанням для її застосування є локальні опіки 2-го ступеня, що значно обмежує можливості використання. Крім того, в клінічній практиці фахівців не задовольняло тривале перебування пацієнтів під наркозом (до години, іноді більше), необхідне для повноцінного ферментативного поділу шкіри і виділення клітинної суспензії, і відсутність фіксації клітинного матеріалу до раневому ложу, що приводить до «стікання» суспензії при розташуванні ран на бічних поверхнях тулуба і / або кінцівок.

Для зменшення зазначених недоліків фахівці ФГБУ «ПФМІЦ» МОЗ Росії розробили оригінальний спосіб лікування опікових ран [2], також заснований на застосуванні суспензії свежевиделенних аутологічних клітин шкіри пацієнта. Його застосування дозволило отримати хороші клінічні результати при лікуванні дітей [1] з опіковими ураженнями шкіри як 2-й, так і 3-го ступеня. При використанні ReCell не фіксуються персональні дані про клітинному матеріалі в кожному конкретному випадку, що ускладнює аналіз отриманих результатів і можливість їх корекції і, на наш погляд, є ще одним недоліком.

Тому було необхідно: по-перше, визначити склад і дати характеристику клітинної суспензії, виділеної з незміненій шкіри пацієнтів з опікової травмою з використанням різних методів ферментативної обробки; по-друге, вибрати оптимальний по простоті й ефективності метод ферментативної обробки; по-третє, визначити вплив на якість отриманого клітинного матеріалу віку постраждалих.

експериментальна частина

Матеріалом для дослідження були біоптати утильний шкіри 18 дітей і 16 дорослих з опіковими ураженнями, взяті під час операцій аутодермопластики. Середній вік дітей становив 2.34 ± 0.69, дорослих - 52.75 ± 2.87 року. Протокол дослідження затверджено локальним етичним комітетом (протокол № 4 від 25.03.2015) та Вченою радою ФГБУ «ПФМІЦ» МОЗ Росії. У кожного пацієнта або його офіційного представника було отримано інформовану добровільну згоду на участь в дослідженні.

Біоптати шкіри забирали в умовах операційної в стерильну пробірку, що містить 0,9% -ний фізіологічний розчин і антибіотики (пеніцилін / стрептоміцин), і доставляли в лабораторію.

В умовах ламінарного боксу шкіру ретельно багаторазово промивали стерильним 0.9% -ним фізіологічним розчином і відокремлювали від залишків підшкірно жирової клітковини. Після чого повторно промивали і переносили в пробірку з 0.25% -ним розчином трипсину. Кілька зразків поділяли на рівні частини, одну з яких поміщали в холодильник при температурі + 4 + 6 ° С на 18 годин, а другу - в термостат при 37 ° С на 1 годину. Після закінчення періоду ферментативної обробки дію ферменту зупиняли додаванням фізіологічного розчину з 10% аутологічної сироватки. Пінцетом обережно відокремлювали епідерміс від дерми по лінії базальної мембрани і фізіологічним розчином інтенсивно змивали клітини з обох шарів шкіри за допомогою шприца або піпетки. Отриману клітинну суспензію збирали в стерильну пробірку, ретельно ресуспендіровалі і використовували для дослідження. Слід зазначити, що при тепловій обробці не завжди відбувалося хороше поділ шарів шкіри. Для роботи був обраний метод холодової ферментативної обробки як більш щадний.

Концентрацію і відсоток життєздатних клітин у суспензії визначали на лічильнику «Countes», Invitrogen, США. Для визначення життєздатності застосовували прижиттєвий барвник трипановий синій.

Фенотипування клітин суспензії проводили на цитофлюориметрії Navios Becman Coulter, США за допомогою панелі антитіл Becman Coulter (CD 45PC5, CD 14 PC5, CD HLA-DR PC7, CD 34PC7, Cetokeratin_Fitc, CD 90Fitc, CD 105PE, CD 44Fitc, CD 73PE, CD 10PC7 , CD 13 PC5 з відповідними ізотіпіческімі контролями). Для фенотипування використовували від 500 тисяч до 1 мільйона клітинної суспензії з кожної проби.

Частина клітинної суспензії (200 тис. / Кв. См) засівали на чашки Петрі (S = 7 кв. См, «Costar») в середовищі DMEM з додаванням антибіотиків (пеніцилін / стрептоміцин), 2% глутаміну і 10% телячої ембріональної сироватки і поміщали в СО2 - інкубатор при 5% СО2, 37 ° С і абсолютної вологості. Для роботи використовували реактиви та середовища виробництва ТОВ «ПанЕко» Москва, Росія. Кожні 24 години контролювали стан культури на пластиці за допомогою інвертованого мікроскопа «Leica DM I 3000B», оснащеного відеокамерою і програмою «LAS V 4.3», при збільшенні × 50, × 100, × 200. Використовували метод світлого поля і фазового контрасту. Через 48 годин після початку інкубації міняли середу. Надалі зміну середовища проводили кожні 48 годин. За зростанням клітин на пластиці спостерігали протягом 96-144 годин до утворення субконфлюентного моношару. Після чого культуру на частини чашок фарбували за допомогою стандартної забарвлення АЗУР-еозином за Романовським, а частина чашок з культурою передавали для імуногістохімічного дослідження.

Імуногістохімічне дослідження проводили на монослое клітин в чашках Петрі, де клітини були попередньо зафіксовані 70% -ним етанолом. Протокол дослідження включав інкубацію клітин з первинними антитілами з подальшою візуалізацією на основі використання системи детекції UltraVision Quanto (Lab Vision Corporation, USA) і її протоколу (без блокування пероксидазною активності і протеїнового блоку).

Були використані моноклональні мишачі антитіла до поверхневого білку фібробластів людини (Monoclonal mouse antibody to human fibroblast surface protein), clon 1B10 (Diagnostic BioSystems, USA), моноклональні мишачі антитіла до Cytokeratin Pan (CKPAN), clon AE1 / AE3 і моноклональні кролячі антитіла до Vimentin , clon SP20 (Lab Vision Corporation, USA). Фарбування проводили відразу двома антитілами в одній чашці Петрі, розмежовує сфери їх нанесення гідрофобним олівцем. Ядра клітин дофарбовували гематоксилином Майера.

Для статистичної обробки результатів застосовували методи непараметричної статистики з використанням пакета програм STATISTICA 6. Статистичний аналіз включав оцінку нормальності розподілу, визначення середнього арифметичного (М ± m), t-критерію Стьюдента. Відмінності вважали статистично значущими при ймовірності помилки p <0.05.

Результати та обговорення

У виділеної суспензії фіксували клітини різного розміру, округлої і полігональної форми, без ознак деградації. У зразках, отриманих після теплової ферментативної обробки, зазначалося досить велика кількість клітинного детриту, після холодової - воно значно менше. Кількість виділених клітин з одного і того ж биоптата при різних способах ферментативної обробки істотно відрізнялося (таблиця 1), так само як і частка життєздатних клітин. При цьому в кожному зразку при використанні методу холодової ферментативної обробки і кількість виділених клітин, і відсоток життєздатних серед них переважали в порівнянні з даними, отриманими при тепловій ферментативної обробці.

Отримані дані узгоджуються з результатами інших авторів, які вказують на більш щадну дію ферменту при холодової обробці, що характеризується великим виходом клітинної маси і частки життєздатних клітин [4].

Таблиця 1

Концентрація і% життєздатних клітин у суспензії при різних способах ферментативної обробки

№ зразка

холодова тріпсінізаціі

теплова тріпсінізаціі

Кількість клітин з 1 кв. см биоптата

% Життєздатних клітин

Кількість клітин з 1 кв. см биоптата

% Життєздатних клітин

1

7.3 × 106

81%

6.9 × 105

70%

2

7.6 × 106

84%

4.8 × 10 6

50%

3

10.8 × 106

76%

6.1 × 10 6

39%

4

8.9 × 106

78%

4.8 × 10 6

48%

5

7.0 × 106

80%

1.7 × 10 6

69%

6

7.8 × 106

81%

2.0 × 10 6

66%

Подальше дослідження проводили тільки із зразками шкіри, обробленими методом холодової тріпсінізаціі. При проведенні холодової ферментативної обробки порівнювали ефективність виділення клітин з 1 кв. см биоптата шкіри, отриманого від постраждалих дитячого віку, і з біоптату такої ж площі, отриманого у дорослих. Результати представлені в таблиці 2.

Таблиця 2

Характеристика клітин суспензії залежно від віку постраждалих

Групи

вік постраждалих

Життєздатність в% (М ± m)

Кількість клітин, виділених з 1 кв. см биоптата (M ± m)

діти

2.34 ± 0.69

80.39 ± 3.02%

12.88 ± 0.75 млн

дорослі

52.75 ± 2.87

76.82 ± 4.44%

7.17 ± 4.44 млн

P

1.000

1.000

Концентрація клітин в суспензії, виділеної методом холодової тріпсінізаціі, коливалася від 6 до 20 млн / мл; життєздатність - від 60 до 88%. Статистично значущих відмінностей між даними, отриманими при дослідженні матеріалу від дітей і дорослих при виражених вікових відмінностях, не виявлено.

При фенотипування встановлено, що у всіх пробах переважали (80.4 ± 9.7%) клітини, позитивні на Cetokeratin (внуктріклеточний маркер кератиноцитів). Маркери мезенхімальних клітин (CD 90+, CD 105PE +, CD 44+, CD 73+, CD 10+, CD13 +) визначалися на 14.2 ± 5.6% клітин, що свідчило про присутність в клітинній суспензії клітин мезенхімального походження - імовірно фібробластів (основної популяції клітин дерми). Маркери гемопоетичних клітин (CD 45, CD 14, CD HLA- DR, CD 34) становили не більше 4-6%, а в ряді зразків не визначалися.

При спостереженні за ростом клітин в культурі вже через 24 години фіксували адгезію одиничних клітин до пластику, однак основна маса клітин залишалася в середовищі (рис. 1).

Мал. 1. Взвесь аутологічних клітин на чашці Петрі через 24 години культивування (збільшення × 100, фазовий контраст)

На рис. 1 видно поодинокі розпластані клітини веретеновидной або зірчастої форми з вираженими відростками (фібробласти) і переважні, як плаваючі в середовищі, так і прикріпилися до пластику, клітини полігональної і округлої форми (кератиноцити), а також дрібні клітини округлої форми (клітини крові).

Через 48 годин число клітин, фіксованих до пластику, збільшувалася (рис. 2). Після зміни середовища на поверхні пластика видно: полігональні і округлі клітини з великими ядрами, клітини веретеновидной або зірчастої форми з вираженими відростками, крім того, спостерігали скупчення клітин різної форми і розмірів.

Мал. 2. Культура аутологічних клітин на чашці Петрі через 48 годин культивування (збільшення × 100, фазовий контраст)

Через 96-144 години на поверхні культурального судини відзначали формування субконфлюентного моношару. Клітини монослоя покривали до 70-80% поверхні. У ці терміни культуру фіксували і фарбували безпосередньо на пластиці. Моношар був сформований великими клітинами полігональної форми з центрально розташованими великими ядрами, в яких визначалися 3-4 ядерця. Форма і розміри клітин відповідали таким для клітин епідермісу. Крім того, на поверхні фіксувалися поодинокі веретеновідние клітини з вираженими відростками, що характерно для фібробластів. Частина зразків використовували для імуногістохімічного дослідження. Фарбування проводили відразу двома антитілами в одній чашці Петрі, розмежовує сфери їх нанесення гідрофобним олівцем. Ядра клітин дофарбовували гематоксилином Майера.

Мал. 3. Cytokeratin Pan-позитивні клітини в культурі (імуногістохімічне фарбування антитілом Cytokeratin Pan, збільшення × 400)

Імуногістохімічне фарбування антитілами до Cytokeratin Pan і Vimentin дозволило наочно диференціювати фібробласти і кератиноцити. Забарвлення цитоплазми Cytokeratin Pan свідчила про наявність в цій культурі епітеліальних клітин, а різна інтенсивність фарбування клітин у зразках демонструвала багатошаровість (шаруватість) культури (рис. 3). Клітини Cytokeratin Pan-позитивні відрізняються за формою і розмірами від Vimentin-позитивних фібробластів (рис. 4), на тлі інтенсивно забарвленої цитоплазми яких чітко проглядаються ядра нефарбованих кератиноцитів.

Мал. 4. Віментин-позитивні клітини в культурі (імуногістохімічне фарбування антитілом Vimentin, ув. × 400)

Таким чином, проведене дослідження клітинної суспензії, виділеної із зразків незміненій шкіри пацієнтів з опікової травмою різного віку, продемонструвало наявність в її складі як клітин епідермісу - кератиноцитів, так і основних клітин дермального шару - фібробластів. Це підтверджується виявленням різними методами (цитофлюориметрії, імуногістохімія) в складі суспензії клітин як несучих маркери кератиноцитів (цитокератин), так і маркери, типові для клітин мезенхіми - фібробластів: виментин, CD 90+, CD 105PE +, CD 44+, CD 73+, CD 10+, CD13 +. Мікроскопічно форма клітин також відповідає основним типам клітин двох шарів шкіри. Висока життєздатність клітин в виділеної суспензії і здатність до адгезії і проліферації на пластиці зі збереженням характерних особливостей демонструє повноцінність виділених клітинних елементів. Слід зазначити, що дослідження матеріалу, отриманого від дітей і дорослих, по життєздатності і кількості виділених клітин з одного квадратного сантиметра не виявило статистично значущих відмінностей, тобто вік потерпілого не впливає на характеристику отриманої з його шкіри клітинної суспензії.

Висновок. Таким чином, суспензія свежевіделенніх клітін, получил з незміненій кожи пацієнтів з опікової травмою, складається з основних клітінніх елементів ее обох шарів: і кератіноцітів, и фібробластів. Аутологічні клітини після виділення зберігають високу життєздатність і функціональну активність, так як визначається їх виражена адгезія до пластику, зберігається проліферативна активність і здатність до експресії типових рецепторів. Характеристики клітин суспензії не залежить від віку постраждалих. В результаті показано, що при використанні методу холодової тріпсінізаціі з незміненій шкіри пацієнтів з опікової травмою отриманий клітинний матеріал з хорошими властивостями, і це відкриває перспективи для його клінічного застосування.

бібліографічна посилання

Алейник Д.Я., Чарикова І.М., Давиденко Д.В., Рубцова Ю.П. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛІТИННОЇ зважити, виділених з незміненої шкіри ЯКІ ПОСТРАЖДАЛИ З ОПІКОВОЇ ТРАВМОЮ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 2 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26332 (дата звернення: 07.07.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)