Віруси папіломи людини і Епштейна-Барр в патогенезі інвертованою папіломи і асоційованої з нею сіноназальной карциноми

автори:

• А. А. Бахтін
  ФГБУ «Науково-клінічний центр оториноларингології» Федерального медико-біологічного агентства Росії, Москва, Росія
• В. П. Бикова
  ФГБУ «Науково-клінічний центр оториноларингології» Федерального медико-біологічного агентства Росії, Москва, Росія
• Н. А. Дайхес
  ФГБУ «Науково-клінічний центр оториноларингології» Федерального медико-біологічного агентства Росії, Москва, Росія
• О. В. Карнеева
  ФГБУ «Науково-клінічний центр оториноларингології» Федерального медико-біологічного агентства Росії, Москва, Росія

Журнал: Архів патології. 2018; 80 (4): 3-8

Переглянуто: 1 318 Завантажено: 775

Епітелій ектодермального походження, що вистилає порожнину носа, також званий шнейдеріановой мембраною, відповідно до сучасної класифікації ВООЗ [1] є джерелом трьох морфологічних типів шнейдеріановой папіломи: інвертованою, онкоцитарна і екзофітної. Справжні інвертовані папіломи (ІП) характеризуються инвагинацией покриває слизову оболонку епітелію - багаторядного циліндричного миготливого, перехідного, багатошарового плоского в підлягає строму [2]. Інвагінат мають форму булавоподібних занурень з дихотомічний розгалуженням і формуванням структур, що мають вид проток. При цьому слід зазначити, що епітеліальні інвагінат, будучи продовженням покривного епітелію, завжди мають просвіт і оточені базальноїмембраною, що не дозволяє говорити про їхню справжню інвазії. В даний час ІП порожнини носа відносять до групи доброякісних пухлин з місцево-деструирующим зростанням [1].

Вважають, що ІП можуть розвиватися на основі фіброзно-оточених поліпів [3, 4], розглядається також участь інфекційних чинників - вірусів [5, 6] і виникнення їх de novo [7].

Вірусна теорія походження пухлини базується на великому фактичному матеріалі, а саме регулярному виявленні в клітинах різних пухлин вірусної ДНК, існування в природі подібних вірусів, здатних ініціювати зростання пухлин у експериментальних тварин, а також епідеміологічних даних, що підтверджують зв'язок між пухлинним процесом і наявністю вірусного матеріалу в клітинах пухлини [8]. Так, на сьогоднішній момент не викликає сумніву участь вірусу папіломи людини (ВПЛ) в етіології ювенільного респіраторного папіломатозу гортані [9, 10] і раку шийки матки [11]. Перше припущення про вірусної етіології ВП належить О. Jarvi [12], пізніше цю точку зору підтримали ряд дослідників [5, 13, 14]. Інші дослідники [15-17] заперечують вірусну етіологію ВП, так як вони не змогли виявити слідів діяльності вірусу ні в ядрі, ні в цитоплазмі.

Незважаючи на широке використання імуногістохімічних методів і гібридизації in situ, питання про зв'язок ІП з ВПЛ так і не вирішено. Так, в більшості робіт із застосуванням імунопероксидазному методу в ІП вірус ВПЛ що невиявлений, проте наявність генома ВПЛ в ІП доведено методом гібридизації in situ і ПЛР, при цьому найбільш часто виявляли ВПЛ 6-го і 11-го типів, рідше - ВПЛ 16- го і 18-го і виключно рідко - ВПЛ 57-го типу [5, 18]. Частота виявлення вірусу варіювалася від 0 до 100%. Тому залишається незрозумілим, чи є вірус ВПЛ етіологічним фактором або супроводжує І.П. Проте останнім часом з'являється все більше робіт [11, 19], в яких досліджуються етапи взаємодії ВПЛ з епітеліальними клітинами і участь в канцерогенезі.

Мета дослідження - визначити можливу присутність ДНК вірусів Епштейна-Барр та ВПЛ 6, 11, 16, 18, 35, 43-го типу в ІП, а також асоційованої з нею сіноназальной карциноме.

Матеріал і методи

Робота виконана на операційному матеріалі, отриманому при спостереженні 76 випадків ІП та 4 - сіноназальной раку, які розвинулися на тлі ІП, 45 проб відібрано для постановки ПЛР.

ПЛР in Real time. Виділення ДНК проводили з парафінових зрізів з використанням набору Екстракт ДНК FFPE (ТОВ HOMOTEK, Москва) згідно з інструкцією. Визначення концентрації виділеної ДНК людини підтверджували за допомогою методу кількісної ПЛР в реальному часі з використанням тест-системи для виявлення гена сурвівіна людини для наукового застосування (ТОВ «Нанодіагностіка», Москва). Для оцінки фрагментації ДНК розроблений підхід на основі ампліфікації фрагментів з різною довжиною амплікон. Для цієї мети використані 3 пари праймерів для ампліфікації гена сурвівіна геномної ДНК людини з довжиною амплікона 95, 213 і 317 пар основ (ТОВ «Нанодіагностіка», Москва). Кожну систему праймерів попередньо калібрували на нефрагментовані ДНК людини з відомою концентрацією. Проведено скринінг 46 зразків за допомогою наборів для виявлення ВПЛ 6, 11-го, ВПЛ 16, 35-го, ВПЛ 18, 45-го типів методом ПЛР в реальному часі з Такман-зондами (ТОВ «Нанодіагностіка», Росія). Дослідження проводили на приладі CFX-96 ( «Bio-Rad», США) за наступною програмою: 5 хв - 95 ° C; 40 циклів: 10 с - 95 ° C, 20 с - 60 ° C, 10 с - 70 ° C. Кожен зразок аналізували в двох незалежних експериментах з двома повтореннями в кожному. Результати обробляли за допомогою програми CFX-Manager ( «Bio-Rad», США).

Імуногістохімічне дослідження (ІГХІ). За результатами ПЛР-дослідження відібрано 15 зразків з найменшими граничними циклами (Ct) до ВПЛ різних типів. З обраних блоків (15 спостережень) готували зрізи товщиною 4 мкм, які наносили на високоадгезивні скла (X-tra Adhesiva, «Leica Biosystem») і висушували при температурі 37 ° C протягом 12 год. Відновлення антигенної активності проводили в цитратному буфері Epitope Retrival Solution, рН 9,0 ( «Leica Biosystem») при температурі 120 ° C протягом 20 хв і наступному охолодженні 90 хв. В якості первинних антитіл використовували моноклональні кролячі антитіла до HPV L1 (клон: K1H8) фірми «Dako» в розведенні 1:50. Як детекціонний системи застосовували Novolink Polymer Detection System ( «Leica Biosystem»), в якості хромогену - діамінобензідін. Реакцію оцінювали напівкількісним методом за інтенсивністю фарбування: відсутня (0), слабка (+), помірна (++) і значна (+++) експресія.

результати

З 45 досліджуваних зразків ІП внаслідок вираженої деградації ДНК лише 38 проб виявилися придатними для подальшого аналізу. У 13 зразках ІП ДНК ВПЛ, не знайдено, в 20 випадках виявлено ВПЛ 6-го типу в 3 з них виявлено також 11-й тип ВПЛ, в 1 - тільки ВПЛ 11-го типу. ВПЛ 16, 18, 35, 45-го типів і вірус Епштейна-Барр що невиявлений ні в одному зі спостережень ІП (табл. 1).

Таблиця 1. Проби з помірною і низьким ступенем деградації ДНК. Група інвертованих папілом Примітка. Тут і в табл. 2: зелений - високий вміст ДНК, жовтий - середній вміст, червоний - дуже низький вміст, порожні клітинки - негативний результат.

Тільки в 1 з 4 випадків сіноназальной карциноми на тлі ІП виявлено ВПЛ 16-го і 35-го типів. Вірус Епштейна-Барр не найден (табл. 2).

Таблиця 2. Проби з помірною і низьким ступенем деградації ДНК. Група сіноназальной раків на тлі інвертованих папілом

При ІГХІ в тканинних зрізах, отриманих із зразків з пороговим циклом 18 Ct ДНК ВПЛ 6-го типу, у всіх полях зору визначали виражену іммунопозітівную цитоплазматическую реакцію у вигляді гранул в лімфоцитах і клітинах гістіоцитарно-макрофагального ряду (рис. 1, а),

Мал. 1. Іммунопозітівная цитоплазматическая реакція на HPV (clon: K1H8) в сіноназальной інвертованою папіломі при різних концентраціях ДНК ВПЛ 6-го типу, визначеної за допомогою ПЛР. а - 18,00 Ct; б - 18,00 Сt; в - 27,06 Ct; г - 34,34 Ct. Імунопероксидазний метод. DAB-chromogen. х400. а також помірну реакцію в одиничних базальних клітинах епітеліального пласта ІП (див. рис. 1, б). У зрізах зразків з пороговим циклом 27,06 Ct ДНК ВПЛ 6-го типу весь епітеліальний пласт був іммунонегатівен зі збереженням иммунореактивности в клітинах гістіоцитарно-макрофагального ряду (див. Рис. 1, в). При пороговому циклі ДНК ВПЛ 6-го типу, що дорівнює 34,34 Ct і більш, все поля зору були іммунонегатівни до HPV L1 (див. Рис. 1, г).

В одному випадку сіноназальной раку, асоційованого з ІП, відзначали гранулярную цитоплазматическую іммунопозітівную реакцію в невеликих групах базальних і Супрабазально клітин, а також в поодиноких поверхневих епітеліоцитах (рис. 2).

Мал. 2. Іммунопозітівная цитоплазматическая реакція на HPV (clon: K1H8) в сіноназальной карциноме, асоційованої з інвертованою папилломой. Імунопероксидазний метод. DAB-chromogen. х400.

Обговорення

Слід зазначити, що, незважаючи на високу чутливість і достовірність ПЛР, цей метод в силу особливостей виділення вірусної ДНК з зразка, який передбачає повне руйнування клітинних і тканинних структур, не дозволяє судити про наявність вірусної ДНК в тій чи іншій клітці (епітелій, клітини крові, стромальні елементи), хоча є прямим доказом наявності ДНК ВПЛ в досліджуваному зразку. На відміну від ПЛР иммуногистохимический метод дослідження, заснований на реакції антиген-антитіло, спрямований на виявлення різних білкових продуктів вірусу, зокрема пізнього капсидних білка ВПЛ L1. Перевагою ІГХІ є можливість зв'язати результати з топікою процесу, т. Е. Локалізувати антиген.

Провівши зіставлення цих двох методів, ми визначили значення порогового циклу, рівного 27,06 Ct, при якому можна виявити капсидний білок HPV L1 в епітеліальних і гістіоцитарно-макрофагальні клітинах строми, використовуючи ІГХІ. При ПЛР-діагностики в 59% випадків (20 зразків) виявлено ВПЛ 6-го типу. У 18 (86%) з 21 випадку вивчених ПЛР-позитивних ІП концентрація ДНК ВПЛ була низькою, з циклом більш 30 Ct. Присутність вірусу Епштейна-Барр, а також ВПЛ 16, 18 35, 45-го типу при ПЛР-діагностики у всіх випадках ІП дало негативні результати. Іншими словами, високе значення порогового циклу Ct вказує на вкрай низьку концентрацію ДНК ВПЛ в досліджуваному зразку і, отже, на вкрай низький наявність білкових продуктів вірусу або їх повна відсутність. На нашу думку, ця обставина може пояснити іммунонегатівную реакцію в різних дослідженнях [20]. З огляду на вищевикладене, можна припустити, що ВПЛ 6-го типу є «сателітом» ІП, оскільки прямих доказів участі ВПЛ 6-го типу в патогенезі ІП не знайдено. Крім того, існують роботи, що показують наявність ВПЛ в незміненій слизовій оболонці порожнини рота [21]. Що стосується сіноназальной карциноми на тлі ІП, то ПЛР виявила ВПЛ 16-го і 35-го типів тільки в 1 з 4 спостережень. При ІГХІ в цьому ж випадку сіноназальной раку, асоційованого з ІП, отримана іммунопозітівная цитоплазматическая реакція HPV L1 з локалізацією в базальних і парабазальних епітеліоцитах пухлини (див. Рис. 2). Відомо, що 16-й і 35-й типи ВПЛ відносяться до високоонкогенні групі. У нашому матеріалі ці типи ВПЛ виявлено за допомогою ПЛР та ІГХІ тільки в 1 випадку з 4 сіноназальной раку. Ця обставина не знімає з порядку денного участь даних типів ВПЛ в етіології сіноназальной раку, асоційованого з ВП.

висновок

З огляду на низьку концентрацію ВПЛ, виявлену тільки для 6-го і 11-го типів, а також імуногістохімічне виявлення HPV L1 в лімфоцитах і клітинах гістіоцитарно-макрофагального ряду елементів пухлини і окремих базальних епітеліальних клітинах в одиничних випадках, можна припустити, що вірус ВПЛ не грає вирішальну роль в якості етіологічного фактора інвертованою папіломи. У сіноназальной карциноме, асоційованої з інвертованою папилломой, лише в 1 випадку з допомогою ПЛР виявлено ВПЛ 16-го і 35-го типів, що робить передчасним твердження про виняткову роль цього вірусу в етіології даного раку. З урахуванням суперечливих даних літератури наші результати не знімають з порядку денного участь даних типів ВПЛ в патогенезі цього типу раку. Припускаємо, що ВПЛ 16-го і 35-го типів беруть участь в розвитку інвертованою папіломи в сторону злоякісної трансформації. Вірус Епштейна-Барр не знайдено жодного в одному випадку інвертованою папіломи і сіноназальной раку за допомогою ПЛР та ІГХІ. Результати нашого дослідження збігаються з даними, отриманими іншими авторами, які зіставляли результати ПЛР при аналізі ДНК ВПЛ в інвертованою папіломі і сіноназальной карциноме з результатами гібридизації in situ [14].

Участь авторів:

Концепція і дизайн дослідження - А.А.Б.

Збір та обробка матеріалу - А.А.Б.

Написання тексту - А.А.Б., В.П.Б.

Редагування - А.А.Б., В.П.Б., Н.А.Д., О. В. До

Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Відомості про авторів

Бахтін Артур Олександрович - канд. мед. наук, зав. отд-ням патологічної анатомії; https://orcid.org/0000-0003-0232-0545; e-mail: [email protected]

Список літератури:

1. Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D, eds. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours. Lyon: IARC Press; 2005: Додати 28-35. https://doi.org/10.1007/s12105-017-0785-2
2. Бахтін А.А. Клініко-морфологічні особливості сіноназальной папіломи. В кн .: Матеріали V з'їзду Російського товариства патологоанатомів. Челябінськ. 2017; 40-41.
3. Головін Д.І., Двораківська І.В. Пухлини носа і придаткових пазух. Л .: Медицина; 1972; 17-30.
4. Stammberger H. Neue Aspekte zur Genese des Invertierten Papilloms. Erste Mitteilung. Laryngo-Rhino-Otologie. 1983; 62 (6): 249-255. https://doi.org/10.1055/s-2007-1008425
5. Brandwein M, Steinberg B, Thung S, Biller H, Dilorenzo T, Galli R. Human papillomavirus 6/11 and 16/18 in Schneiderian inverted papilloma. In situ hibridisation with human papillomavirus RNA probes. Cancer. 1989; 63 (9): 1708-1713.
6. Kashima HK, Kessis T, Hruban RH, Wu TC, Zinreich SJ, Shah KV. Human papillomavirus in sinonasal papillomas and squamous cell carcinoma. The Laryngoscope. 1992; 102 (9): 973-976. https://doi.org/10.1288/00005537-199209000-00003
7. Vrabec DP. The inverted schneiderian papilloma: a clinical and pathological study. The Laryngoscope. 1975; 85 (1): 186-220. https://doi.org/10.1288/00005537-197501000-00014
8. Антонів В.Ф., Міцконас А., Антонів Т.В., МАТЬОЛА І.І. Папіломатоз гортані. Роль вірусу папіломи людини, перспективи діагностики та лікування. Вісник оториноларингології. 2004; 3: 54-57.
9. Герайн В. Молекулярно-біологічні аспекти ювенільного респіраторного папіломатозу і його комбіноване лікування. Вісник оториноларингології. 1996; 4: 3-8.
10. Плужников М.С., Катінас Є.Б., Рябова М.А., Карпіщенко С.А., Верещагіна О.Е., Сисоєв К.А., Чухловін А.Б., Тотолян А.А. Клініко-імунологічна характеристика рецидивного респіраторного папіллматоза. Російська оториноларингологія. 2006; 3: 22-27.
11. Хансон К.П., Імянітов Е.Н. Сучасне уявлення про канцерогенезі раку шийки матки. Практична онкологія. 2002; 3 (3): 145-155.
12. Von Osmo Jarvi. Kieferhöhlenpapillom mit (virusbedingten?) Cyto-plasmaeinschlüssen. Acta Oto-Laryngologica. 1944; 32 (3): 284-291. https://doi.org/10.3109/00016484409119915
13. Eggston AA, Wolf D. Histopathology of the ear, nose and throat. Baltimore; 1947.
14. Hoffmann M, Klose N, Gottschlich S, Gorogh T, Fazel A, Lohrey C, Kahn T. Detection of human papillomavirus DNA in benign and malignant sinonasal neoplasms. Cancer Letters. 2006; 239 (1): 64-70. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2005.07.019
15. Gaito RA, Gaylord WH, Hilding DA. Ultrastructure of a human nasal papilloma. The Laryngoscope. 1965; 75 (1): 144-152. https://doi.org/10.1288/00005537-196501000-00016
16. Oberman HA. Papillomas of the nose and paranasal sinuses. Am J Clin Pathol. 1964; 42 (3): 245-258. https://doi.org/10.1093/ajcp/42.3.245
17. Weissler MC, Montgomery WW, Turner PA, Montgomery SK, Joseph MP. Inverted papilloma. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1986; 95 (3 Pt1): 215-221. https://doi.org/10.1177/000348948609500301
18. Zhou Y, Hu M, Li Z. Human papillomavirus (HPV) and DNA test in inverted papillomas of the nasal cavities and paranasal sinus. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 1997; 32 (6): 345-347.
19. Robboy SJ, Anderson MC, Russel PR. Cervical precancer. In: Pathology of the female reproductive tract. Edinburg: Churchill Livingston; 2002; 165-194.
20. Başak K, Kayıpmaz Ş, Köse Hİ, Karadayı N. Human papilloma virus and Epstein-Barr virus in sinonasal inverted papilloma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2015; 119 (3): 133-134. https://doi.org/10.1016/j.oooo.2014.07.135
21. Syrjänen S. Human papillomavirus (HPV) in head and neck cancer. J Clin Virol. 2005; 32: 59-66. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2004.11.017