Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Cell висіву є важливим кроком. Здатність клітин дотримуватися волокна в 3D набору параметрів значно менше, ніж спостерігається для 2D тканинної культури пластика. Це, ймовірно, через зменшення часу контакту між кліткою і підкладкою. У HFB клітини потрапляють через модуль під час статичних фаз висіву. Вони значно коротше за часом у порівнянні з однієї безперервної статичної фази, використовуваної в 2D. Клітки повинні підключатися до підкладки в цей час. Крім того, в зв'язку з вигнутим природа волокон не пласка поверхня для осередку, щоб відпочити і зробити зв'язку, як є в 2D культурі. Хоча це може бути змішаний з хімії волокна використовували ми знаємо, що це не має місце для полімеру, використовуваного в цьому дослідженні (дані не показані). Збільшення часу посіву і щільність посіву клітин призводить до утворення агрегатів клітин, які потрапляють через модуль під час статичних фаз при більш швидкому Rпоел, ніж окремі клітини і додатково зменшує час контакту між клітинами і субстратом. Збільшення часу також призводить до пожовтіння ЗМІ як існує висока щільність клітин і ніякого обміну медіа під час цього кроку. Використовуючи умови, описані в розділі 4 швидкостей клітин висіву ~ 15% послідовно досягається з HepG2 / C3À клітин (рис 5А). Хоча це може розглядатися як низька фракція є достатня кількість клітин для генерації добре густонаселені волокон протягом декількох днів (цифри 5B і 6); Наступний період поширення семиденний щільність клітин досягала в HFB наближається 3х10 5 / см 2. Це відповідний щільність для багатьох аналізів з використанням печінкових клітин, і можуть вважатися досягнення злиття.

Темпи поширення, досягнуті в HFB повільніше в порівнянні з результатом, що досягається в 2D культурі клітин (рис 5C). Це іпвероятно, пов'язане з втратою клітин в динамічному потоці системи, як кількість клітин в засобах масової інформації є низькими (середнє ± SEM: 20,343 клітини ± 3674 клітин на 24 год при збігу, що становить 4% від загального числа клітин), і це не збільшується, коли швидкість проникнення повернута до 400 мкл / год (дані не показані). Крім того, малоймовірно, що з - за зниження життєздатності і подальшою втратою клітин (дивись малюнок 5D і нижче). Це можна пояснити, по крайней мере, частково за рахунок того, що ця клітинна лінія була клонованих отриманого з HepG2 і обраної на його здатності демонструвати контактна інгібіція проліферації клітин. Клітини в HFB висівають на 6х щільність 2D-клітин, які можуть призвести до уповільнення темпів поширення.

Життєздатність залишається на високому рівні протягом усього HFB з клітинами, які проявляють> 90%. Хоча існує деяке зниження життєздатності на вихідному кінці у порівнянні з вхідним отвором в цьому не було виявлено суттєвого впливу (Т-тест р = 0,22).

Моніторинг споживання глюкози і виробництва молочної кислоти використовується для настройки гучності швидкості подачі засобів масової інформації та засобів масової інформації в системі. За допомогою 800 мкл / год і загальний обсяг носія 50 мл рівні глюкози і молочної кислоти зберігаються вище і нижче (відповідно), які бачили в стандартній тканинної культури, пластичної культури.

Альбумін секреції є ключовою функцією печінки здійснюється гепатоцитів. Він секретується в сироватці, де він грає кілька ролей в транспорті і гомеостазу. Альбумін секреції клітинами, вирощеними в HFB в 15 разів вище, ніж в клітинах, вирощених на 2D (малюнок 7). Це свідчить про те, що клітини функціонують в HFB і, по крайней мере, в разі альбуміну секреції, ця функція підвищується в HFB.

JPG "/>
Малюнок 1. У природних умовах -як середовища з HFB. Клітини висівають на зовнішню поверхню пористих волокон. Медіа доставляється через просвіт волокон, імітуючи капіляр крові. (A), поздовжній перетин волокна (не в масштабі). (B) Поперечний перетин реактора 3 волокна. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 2. HFB модуль. (А) Розміри модуля, використовуваного в даному дослідженні. Розміри були обрані, щоб відповідати 3 волокон і задовольняти потреби нинішнього дослідницького проекту. Різні розміри можуть бути виготовлені і пристосовані для окремих систем і волокон. (Б) фотографія мМОДУЛЬ з прикріпленими торцевої кришки і модуля роз'ємів. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 3. Виготовлення модуля. (A) Волокна розрізають за розміром і вставляється в модуль. (B) Волокна склеюються в модулі, дають висохнути. (C) Кінці зрізають врівень зі склом. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 4. Система HFB настройки. Стрілки вказують напрямок потоку середовища. Червоний = подає трубка. Жовтий = насос Tuбить. Білий = модуль HFB. Зелений = утримуваний трубка з затиском. Синій = пронизувати трубку. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 5. Посів, проліферацію, життєздатність і біохімічний аналіз. (A) Відсоток клітин, посіяних. Чорні алмази є окремі HFBs. Червона смуга є середнім. (B) Клітини щільності при посіві і після періоду проліферації 7 днів. числа 2D-клітин визначали за допомогою обробки трипсином і підрахунок з використанням гемоцітометра. Числа HFB клітин визначали за допомогою аналізу PicoGreen і стандартну криву, отриманий з клітин C3À 26. п = 5-6. Bars = SEM. (C) подвоєння популяції рази. п = 5-7. Bars = SEM. (D) Життєздатність визначається TRYPсіній виключення в кінці проліферації 7 днів. Вхід, центральний і вихід представляють регіони в межах HFB. п = 3-5. Bars = SEM. (E & F) споживання глюкози і виробництво молочної кислоти. Рівні контролювалися на пляшкою (на вході), а також ретентат і пермеата точок і compered до звичайної культури на культуру тканини пластика (ЗМІ змінилися на 3 день і 5). п = 3-5. Bars = SEM. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 6. Зображення клітин, вирощених на волокнах в HFB. Клітини висували і вирощували протягом 48 год, перш ніж волокна були вирізані, промивали в PBS, фіксували в 4% параформальдегіду, промивають в PBS і ядер фарбували DAPI. Кожне зображення являє собою сукупність 12 'фокус складені "ІМАGES для того, щоб збільшити глибину різкості результуючого зображення. Області вищою і більш низької щільності клітин розташовані уздовж волокна в цей момент часу і показані. Там, де присутні кордону волокна позначені червоною пунктирною лінією. зображення були взяті на перевернутої флуоресцентного мікроскопа. зображення = 10X мета. Bar = 200 мкм. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Малюнок 7. Альбумін секреції. Клітини висували на культурі тканини пластика в 10,667 / см 2 і в HFB, як описано в розділі 4. Клітини пролиферируют протягом 6 днів. Після цього періоду поширення культури тканини пластика і HFB культури середу замінювали на бессивороточной Williams E, доповненої глутамином і пеніциліном / streptomyciп протягом 24 годин. Медіа були взяті зразки і альбумін кількісно за допомогою ELISA відповідно до інструкцій виробників (таблиця 1). п = 5-6. Bars = SEM. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

РозділНазва обладнанняКомпаніяКот.Ні.НотаткиЗображень

2 Модуль Glass HFB Сохам Scientific --- користувача елемент. 2.1 Sigmacote® Sigma-Aldrich SL2 2.3 Silicoset 151 Intertronics ACCSS151 кремніевуюодін клей. 2.5 PTFE стрічки Sigma-Aldrich Z104388 3.2.1 пляшкою рибалка 11972619 Q-серія ковпачок кінез 00932Q-3V PTFE гвинтовим різьбленням адаптерів і гайку кріплення. Приєднати до кришки Q-серії. Прикладіть розділ 8.5 см поставляється PTFE трубки під адаптером 1 мм і секцію 4 см під адаптер 3 мм. Адаптер, Чоловічий, 1,0 мм ID кінез 008NB10-KD5L Адаптер, Чоловічий, 3,0 мм ID кінез 008NB30-KD5L Місце Гайка кінез U-350 неопрен трубки рибалка 10366344 Закріпити фільтр Hepa до 6 см з неопрена трубки і прикріпіть до «фитинга гайки ». Докласти 2x 30 мм секції L / S14 трубки з двома верхніми борідки на Y-образного з'єднувача і секції 3 см від L / S16 трубки до нижньої частини. Прикріпіть це до задирки ідентифікаційного адаптера 3 мм. (Розділ 3.2.1) HEPA-вентиляційний рибалка 11374634 Y-роз'єм, колючий Коул Пармер НУ-06295-10 L / S16 Силіконові трубки Коул Пармер НУ-96410-16 L / S14 Силіконові трубки Коул Пармер WZ-96410-14 L / S13 Силіконові трубки Коул Пармер НУ- 96410-13 80 см для підключення 1,0 мм колючий адаптер на Q-серії кришкою в бак насоса ІНГ = Труба подачі. WM 205U / CA насос рибалка 1248-6300 WM насос труби, ПВХ, синій-помаранчевий, 0,25 мм отвір рибалка 12416310 PTFE гвинтова різьба охоплюється адаптера, а адаптер жіночий. Робота трубки насоса по одному з задирок. Повторіть цю настройку на іншому кінці трубки. (Розділ 3.2.1) Адаптер, Чоловічий, 1,0 мм ID кінез 008NB10-KD5L Адаптер, Жінка, 1,0 мм ID кінез 008NB10-KD2L 3.2.2 Жіночий ковпачок Luer Коул Пармер WZ-45508-64 Бічні торцеві кришки порту. blefig4.jpg "/> L / S13 Силіконові трубки Коул Пармер НУ-96410-13 40 мм секція для підключення трубки насоса до гнізда модуля. L / S16 Силіконові трубки Коул Пармер НУ-96410-16 3x 30 мм L / S16 встановлений на 3x редуктори = роз'єми модуля. (Розділ 3.2.2) Колючий редуктор 1/8 "х 1/16" Коул Пармер 30616-43 3.2.4 L / S13 Силіконові трубки Коул Пармер НУ-96410-13 55 см розділ для підключення ретентат до L / S14 з Y- роз'єм на кришці Q-серії. L / S13 Силіконові трубки Коул Пармер НУ-96410-13 45 см розділ для підключення пермеата до L / S14 з Y-роз'єм на кришці Q-серії. Прямий колючий союз Коул Пармер WZ-30612-43 Приєднати до кінця L / S13, який буде з'єднуватися з L / S14 від Y-образного з'єднувача. 3.4.2 затиск VWR 229-0609 4.3 4 мм Силіконові трубки рибалка FB68858 Складіть по ділянці 40 мм трубки і закріпіть за допомогою кабельної стяжки = модуля торцевої кришці. (Розділ 4.3) Кабельні стяжки рибалка 12326377 4.4 ротатор труба MACSmix Miltenyi Biotech 130-090-753 Адаптація може знадобитися АТТАКч модулі. 4.5 Ін'єкція порт Leur Будяк Scientific IB-10820 Прикріпіть бічну кришку до порту уприскування. (Розділ 4.5) Жіночий ковпачок Luer Коул Пармер WZ-45508-64 5 Комплект L-молочної кислоти Megazyme K-ПІЗНІШЕ 5 Комплект D-глюкози Megazyme K-Gluc 6.2 Скальпель / мікро ніж InterFocus 10315-12 7.4.3 Альбумін ELISA Bethyl Labs E80 -129

Таблиця 1. Компоненти HFB настройки. Чонг> Текст розділу ставлення до кожного компоненту дається в колонці 1.