Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Описана процедура дозволяє виділити близько 12 х 10 7 кліток Сертолі з сім'яників 10 щурів. 3 × 10 6 клітки висівають на лунку на 6-ямковий планшет, так що від шести до семи 6-ямкові планшети для експериментів доступні на день 7. Переваривание Трипсин-ДНКази I є найбільш важливим кроком в процесі виділення клітин Сертолі. Якщо травлення в цій точці просувається надто далеко, ставлення зародкових клітин / клітини Сертолі буде непропорційно зростати до кінця. У перший день 3-6 культури важливо ретельно змити стільки незакрепівшіхся або вільно прикріплені зародкові клітини, як це можливо. В якості альтернативи великих прань протягом 4 днів зародкові клітини можуть бути вилучені шляхом гипотонической обробки на 3 день 27. Перевага цього методу полягає в тому, що час клітинної культурі Сертоли зведено до мінімуму, так що клітинні функції заданої Сертоли є потенційно краще зберіг, ніж після тривалого періоду культури.

(Фіг.5В). Оскільки перітубулярних клітини мають сильну проліферативний потенціал, клітин Сертолі культура повинна бути виконана у відсутності сироватки. У присутності 10% сироватки ФТК б становлять приблизно 20% від усіх клітин після 6 днів культивування тоді як його фракція може бути як очікується, буде нижче 1% за відсутності сироватки 7. Практично всі виділені клітини Сертолі є життєздатними про що судили за фарбування трипановим синім (не показаний). Навколо 7 день культивування виділені клітини Сертолі найменш забруднених статевих клітин і клітин перітубулярних (малюнок 4), так що експерименти повинні бути виконані навколо цього дня, якщо це можливо. Для гарної воспроизводимостью важливо повторити експеріментВсегда в той же день культури. Якщо трансфекції плануються вони повинні бути виконані на день 4 або 5, і клітинні екстракти повинні бути зроблені на день 5 або 6.

За не менше двох тижнів в бессивороточной умовах клітини Сертолі реагують на ФСГ і виробляти більше андрогенів-зв'язуючий білок, активатор плазміногену і трансферин при лікуванні ФСГ. Для більш тривалого культури потрібно живильний шар перітубулярних клітин або сироватці. Після чотирьох тижнів культури погіршуватися, і клітини відокремлюються від субстрату 7.

На 6-й день культивування найбільш клітин Сертолі придбали ліпідів крапельки. У більшості клітин одного великого вакуоль сформувала (5С і 5D). Нейтральне вміст ліпідів можуть бути легко візуалізовані за допомогою масла Червоний O фарбування (рис 4F).

На додаток до Сертоли чол Ls зняті ФТК можна культивувати, а (фіг.4 і 4В). ФТК від 10 яєчок дають п'ять T75 колб, які можна очікувати, щоб сформувати зливається шар після 2 днів культури. Як ізольованих клітинах Сертолі свежеізолірованних PTCs забруднені зародкових клітин, які можуть бути в значній мірі видалені пасажів. Колби розщеплюються 1: 2 за допомогою стандартної обробки трипсином, так що 10 флаконів буде конфлюентни на 5 день після виділення. Чистота ізольованих PTCs є> 95% і може бути підтверджена за допомогою альфа-актин гладких м'язів іммунноокрашіванія (рис 5А). З цього дня і далі ФТК може бути використаний для проведення експериментів. Один флакон досить приблизно одного 6-ямковий планшет, і лунки слід конфлюентни на наступний день. Клітини можуть бути пасерувати багато разів, але експерименти повинні бути виконані завжди в той же прохід для того, щоб переконатися, що клітини поводяться відтвореним чином.

завантажити / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Малюнок 1. Морфологія яєчка і документообігу процедури. (A) сектор в сім'яних канальців з прилеглої інтерстиціальної тканини схематично показана. Насіннєвих канальцах укладені в базальній мембрані (БМ) і окружний шаром myoid перітубулярних клітин (ПТК). Зародкового епітелію знаходиться на просвіту стороні базальної мембрани. Клітини Сертолі (SC), що охоплюють весь зародкового епітелію сильно прив'язані до BM і з'єднані між собою за допомогою базолатеральних позиціонується оклюзії переходів, які представляють гематотестикулярного бар'єр (BTB). Їх нерегулярне ядро ​​(N) показує один або кілька трещинние, як поглиблення і містить ядерце. Статеві клітини (GC) в тісному контакті з СК на всіх стадіях їх розвитку. Інтерстиціальний відсіку між канальцями містить клітини Лейдіга (LC) і імунних клітин, таких як макрофаги (МФ), а також кровоносні судини (BV). фігураадаптіровано з Fijak і Мейнхардт 28. (B) Процедура здійснення процедури; колірне кодування, як в (А). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.

Малюнок 2. Насінники з щурів лінії Вістар, вирізають і декапсуліруются. (А) в черевну порожнину відкрита через поздовжнього розрізу, як описано в тексті. Зірочка (*) вказує на epidydimal жирової тканини. (B) Насінники видаляють шляхом розрізання сім'яного канатика і (С), зібраної в 50 мл конічну пробірку, що містить 20 мл PBS. Коли все насінники були зібрані вони дезінфікують в 20 мл 1% (маса / об'єм) йоду в етанолі. Для видалення йоду вони швидко промивають два рази 25 млPBS друг. (D) Насінники після першого прання PBS. (E) Насінники переносять в чашку Петрі (праворуч), і насінні канальці видавлюються розкритою білкову оболонку за допомогою закритих ножиць леза (ліворуч), як описано в тексті. (F) декапсуліруются яєчка ще утворюють компактний яєчок-образний масу з поодинокими канальці опуклі. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.

Малюнок 3. Виділення клітин Сертолі. (А) Після видалення інтерстиціальних клітин трипсином-ДНКази I травлення і пральних 9x з PBS канальців стати мобілізовані і виглядають чистими. (Б) Під час колагенази-гіалуронідаза-ДНКази I лікування перітубулярних клітини з шару і зародкових клітин зовнішніх звільняються. Трубки отримати скорочений і отримати грубий вид. (С) Трубчасті фрагменти після миття 4x з PBS. Випуски лікування (D) Гиалуронидаза-ДНКази I залишкові перітубулярних клітин, а також статевих клітин. Трубочки отримати додатково скорочується, і трубчасті агрегати утворюють. (Е) Трубчасті агрегує після миття 4x з PBS. Клітини (F) Одномісний Сертоли проводиться шляхом пропускання агрегати 10х через 18G голки. Масштабні бари в (AE) = 200 мкм, в (F) = 50 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.

Малюнок 4. Культура перітубулярних клітин (АВ) і клітини Сертолі (CF) і видалення contaminat ING зародкові клітини. (A) ресуспендувати ФТК від етапу 4.5 висували відразу і сфотографували на наступний день. (Б) Після поділу на 3-й день зараження статевих клітин зменшується. (C) На 4-й день клітини Сертолі показана типова бруківкою, як зразок. Плаваючі і дотримуючись зародкові клітини видно до миття з PBS. (D) Те ж добре після миття 3x з PBS. Кількість забруднюючих зародкових клітин зменшується. Пральна тричі PBS повторюється на 5-й день і 6. (Е) на 6 день культури практично всі статеві клітини були видалені. Клітини Сертолі сформували унікальний дивлячись клітинний шар, і більшість клітин придбали один великий вакуоль. Червоний O фарбування (F) Нафта показує, що ці вакуолі ліпідні краплі, що містять в основному нейтральні ліпіди. Масштабні бари в (AD) = 200 мкм, в (Е) = 50 мкм і в (F) = 25 мкм..jpg "цільових =" _blank "> Натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.

Малюнок 5. імунофлуоресценція фарбування. Фарбування очищених первинних перітубулярних клітин з актином (гладких м'язів) антитіл (а) і клітин Сертолі з віментину антитіла (B). Немає забруднюючі клітини не видно в обох полях зору. Вимірювальна лінійка в (А) і (В) = 10 мкм. (С) і (D) Електронно-мікроскопічні знімки клітин Сертолі після 4 днів в культурі. (C) Зверніть увагу на тісні контакти сусідніх клітин (стрілки), що призводить до брукової, як шаблон, як показано на фіг.4С. Один крапель ліпідів (L) спостерігається в цитоплазмі кожної клітини. (D) Найбільш рясні органели мітохондрії (М) і апарат Гольджі (G) .Ядро (N) містить ядерце (NC) і показує типову фиссур, як відступ. Масштабна лінійка в (С) = 1 мкм, а в (D) = 0,25 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.