Лазерное управление генерацией синглетного кислорода в митохондриях для стимуляции репликации митохондриальной ДНК in vitro

1. Клеточные культуры Клетки рака шейки матки человека HeLa культивировали при 37 ° C в атмосфере увлажненного...
2. Измерение кинетики PpIX
3. Обнаружение 1O2 в бесклеточной системе
4. Анализ клеточного цикла
5. Рост клеток
6. Митохондриальное измерение АФК
7. Выделение и очистка ДНК
8. RT-PCR в реальном времени
9. Вестерн-блоттинг
10. Полу-долгосрочная РТ-ПЦР
11. Количественное определение числа копий МтДНК
12. Количественная ПЦР в реальном времени для разных коротких областей мтДНК
13. Короткая интерферирующая РНК (миРНК) трансфекция
14. Измерение 8-oxoG
15. статистический анализ

Клеточные культуры

Клетки рака шейки матки человека HeLa культивировали при 37 ° C в атмосфере увлажненного 95% воздуха / 5% CO2 в среде DMEM с добавлением пенициллина (100 единиц / мл), стрептомицина (100 мг / мл) и 10% эмбриональной сыворотки теленка. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолийбромида (МТТ) через 24 часа после лазерного облучения. Жизнеспособность клеток выражали в процентах от контрольных клеток. Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах.

Воздействие клеток на лазер

На клетки воздействовал красный свет, генерируемый He-Ne-лазером (630 нм, что соответствует максимуму поглощения PpIX в полосе Q) (Институт современной физики Китайской академии наук). Время облучения было скорректировано с учетом энергии от 0,1 до 0,5 Дж / см2. Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах.

Измерение кинетики PpIX

Клетки HeLa собирали в фазе экспоненциального роста и инкубировали при 37 ° С в 96-луночном планшете в 0,2 мл среды DMEM в течение 6 часов. Были выполнены два набора измерений, один с CCCP и один без. Среду посеянных клеток затем заменяли средой, содержащей 200 мкМ ALA. Необработанные клетки использовали в качестве контроля без лекарств. Клетки обрабатывали лекарственной средой в темных условиях в течение 0–12 часов. Затем клетки дважды промывали PBS и измеряли флуоресценцию с помощью планшет-ридера (Tecan infinite 200 M). Длина волны возбуждения составляла 405 нм, а длина волны излучения составляла 631 нм для кинетических измерений. Относительные количества PpIX были нормализованы к общему уровню белка, экстрагированного из параллельных клеток HeLa, что количественно определялось стандартным протоколом BCA.

Обнаружение 1O2 в бесклеточной системе

В качестве агента, отслеживающего 1O2, использовали сенсорный зеленый реагент 1O2 (SOSG) (Invitrogen, США). 100 мкл раствора 400 мкМ PpIX (Sigma) непосредственно смешивали с 100 мкл 200 мкМ SOSG в PBS для изучения влияния лазерного излучения на генерацию 1O2. Измерение флуоресценции SOSG проводили с использованием планшет-ридера (Tecan infinite 200 M) при длине волны возбуждения / излучения 505/525 нм соответственно.

Анализ клеточного цикла

Для анализа клеточного цикла клетки собирали в указанные моменты времени после облучения и фиксировали в 70% этаноле при 4 ° С в течение ночи. После промывки дважды PBS клетки инкубировали с 30 мкг / мл йодида пропидия (PI), 0,2 мг / мл РНКазы A и 0,2% Triton X-100 (Sigma) при 37 ° C в течение 30 минут. Затем клетки анализировали проточной цитометрией (BD Biosciences).

Рост клеток

Мониторинг роста клеток в режиме реального времени проводился как наше предыдущее исследование. 52 , Вкратце, рост клеток определяли путем мониторинга прикрепленных клеток в режиме реального времени системой RT-CES (ACEA Biosciences). 5000 клеток высевали в каждую лунку на 360 мкл со средой на 200 мкл за 14 часов до измерения, чтобы гарантировать их прилипание к планшет-регистратору. Среду заменяли каждые 24 часа. Пролиферация клеток HeLa регистрировалась каждые 2 часа в течение 72 часов.

Митохондриальное измерение АФК

Для измерения ROS митохондрий, MitoSOX был использован для количественной оценки уровень и другие окислители в митохондриях. Клетки HeLa собирали в фазе экспоненциального роста и инкубировали при 37 ° С в 96-луночном планшете в 300 мкл среды DMEM в течение 6 часов. В указанные моменты времени после обработки клетки дважды промывали PBS, затем обрабатывали 1 мкМ MitoSOX Red (Life Technologies, США) в бессывороточной среде DMED в течение 20 минут при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2. После обработки клетки дважды промывали PBS и измеряли интенсивность флуоресценции, используя возбуждение при 510 нм и излучение при 580 нм.

Выделение и очистка ДНК

Тотальную ДНК очищали с использованием ДНК Blood and Tissue Kit (Tiangen) из клеток с / без ионизирующего излучения соответственно, а количество и чистоту ДНК определяли спектрометрическим анализом. Выделенная ДНК показала высокую чистоту (A260 / A280> 1,8) и хранилась при 4 ° C в соответствии со стандартными процедурами.

RT-PCR в реальном времени

Тотальную РНК выделяли с использованием набора для экстракции РНК (Tiangen). Первую цепь кДНК синтезировали в соответствии с протоколом производителя. ПЦР в реальном времени проводили в системе КПЦ-3000 FTC-3000 (FUNGLYN, Канада) с использованием мастер-смеси SYBR Green PCR (Takara, Япония). Праймеры использовали, как показано ниже: TFAM (5′-GGAGGCAAAGGATGATTCGG-3 ′ и 5′-TCGTCCAACTTCAGCCATCT-3 ′) и β-актин (5′-ATGGTGGAATGGTCCAGAA-3 ′ и 5′-CTTTTCACGGTTG). β-актин использовали в качестве внутреннего стандарта. Условия ПЦР были следующими: Условия циклирования включают 40 циклов: 10 с, 95 ° С, 10 с, 55 ° С и 60 с, 72 ° С. Каждый образец анализировали в четырех повторностях, непрерывно контролировали флуоресценцию в зависимости от числа циклов, и значения порогового цикла (Ct) рассчитывали автоматически. Относительное количественное определение мРНК рассчитывали с использованием метода арифметической формулы 2 −∆∆CT.

Вестерн-блоттинг

Все образцы смешивали с загрузочным буфером и подвергали 10% электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле. Каждая полоса была загружена 50–100 мкг одинакового количества белка. Все образцы затем переносили на PVDF-мембраны и блокировали 5% -ным молоком в трис-буферном солевом буфере Tween 20 (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем на мембраны воздействовали первым антителом против TFAM (29 кДа) и β-актина (42 кДа) (Abcam Inc, США) в разведении 1: 1000 в 5% молоке в TBST в течение ночи при 4 ° C, а затем мембраны промывали и инкубировали со вторичным антителом. Связывание антител было обнаружено с использованием усиленной хемилюминесценции (BioRad). Результаты были количественно определены денситометрией с использованием программного обеспечения Image J.

Полу-долгосрочная РТ-ПЦР

Полу-долгосрочную РТ-ПЦР проводили как наше предыдущее исследование 42 , Вкратце, амплификации SLR rt-PCR проводили в системе кПЦР FTC-3000 (FUNGLYN,), и амплификацию контролировали и анализировали путем измерения интеркаляции флуоресцентного красителя в двухцепочечную ДНК, поставляемую набором MightyAMP ver.2 (Takara). Области мтДНК, праймеры и их эффективность ПЦР для rt-PCR показаны в дополнение Table1 ,

Условия ПЦР для разных фрагментов были оптимизированы для достижения сходных эффективностей амплификации, необходимых для сравнения разных ампликонов. Специфичность продукта контролировали с помощью анализа кривой плавления и секвенировали Sangon, Shanghai для идентификации (данные не показаны). Реакционная смесь (общий объем V = 20 мкл) состоит из 1 × смеси MightyAMP в реальном времени (Takara), 500 нМ каждого прямого и обратного праймера и эквивалентных количеств матричной ДНК (10 нг общей ДНК). Условия циклирования включают фазу предварительной инкубации, составляющую 1 мин при 95 ° С, за которой следует 40 циклов: 10 с, 95 ° С, 10 с, 55 ° С и 60 с, 72 ° С. Каждый образец анализировали в четырех повторностях, непрерывно контролировали флуоресценцию в зависимости от числа циклов, и значения порогового цикла (Ct) рассчитывали автоматически.

Анализ данных основан на измерении Ct. Выделенную общую ДНК из необработанного образца брали в качестве эталона. Для каждой из 11 областей мтДНК разницу в Ct использовали в качестве меры относительного повреждения мтДНК с помощью метода 2-ΔCt в зависимости от размера амплификации длинного фрагмента. 53 , Ct облученной мтДНК в сравнении с Ct необлученной мтДНК непосредственно использовали для представления уровня повреждения мтДНК в каждой области. Повреждение ДНК рассчитывали как повреждение на 10 т.п.н. ДНК каждой области мтДНК, включая размер соответствующего длинного фрагмента и отображая как среднее значение по меньшей мере для трех независимых экспериментов.

Количественное определение числа копий МтДНК

Общая геномная ДНК 50 нг была использована для маркеров мтДНК и ядерной ДНК, соответственно, в 20 мкл реакции, содержащей 1X SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, Япония) и 200 нмоль / л каждого праймера. Информация о последовательности, касающаяся праймеров, была следующей: ND1: CACCCAAGAACAGGGTTTGT и TGGCCATGGGTATGTTGTTAA; актин: CAAAACCTAACTTGCGCAGA и TTTTAGGATGGCAAGGGACT. Тройные реакции проводили для каждого маркера в пробирках по 50 мкл с использованием трехступенчатой ​​программы амплификации, состоящей из 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с, 55 ° С в течение 10 с и 72 ° С в течение 10 с. Стандартные кривые были получены в каждой реакции с использованием серийных разведений необработанной геномной ДНК. Относительное количество копий мтДНК рассчитывали как отношение количества амплификации, полученного с маркерами мтДНК, к β-актину для каждого образца и наносили на график в норме для контрольной группы.

Количественная ПЦР в реальном времени для разных коротких областей мтДНК

Этот метод адаптирован из Manbo et al . 19 , Вкратце, амплификации ПЦР проводили, как описано выше. Были использованы четыре области мтДНК, включая области мтДНК цитохром с оксидазу (COII), тРНК, кодирующую глицин (tRNAG), D-петлю (401–490) и D310, и один β-актин ядерной ДНК ( таблица дополнений 1 ). Соотношения мтДНК / нДНК рассчитывали путем деления сигнала мтДНК для каждого гена на сигнал β-актина и выражения отношения в процентах от необработанного контрольного набора, равного 100%.

Короткая интерферирующая РНК (миРНК) трансфекция

Клетки HeLa трансфицировали ген-специфичной миРНК-мишенью TFAM (Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 48 часов с использованием трансфекционного агента Lipofectamine TM2000 в бессывороточной среде в соответствии с протоколом производителя. Клетки, трансфицированные скремблированной миРНК, действовали в качестве контроля без сайленсинга.

Измерение 8-oxoG

Митохондриальная ДНК была выделена с использованием набора для выделения митохондриальной ДНК (Abcam, США). Для определения уровней 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-oxoG) в изолированной ДНК использовали коммерчески доступный набор ELISA от abcam. Анализы были выполнены в соответствии с инструкциями производителя. Стандарт 8-oxoG (0,01–30 нг / мл) или 5 мкг ДНК инкубировали с планшетом, покрытым антимышиным IgG, с индикатором, состоящим из конъюгата 8-oxoG-фермент. Анализ был нормализован равным количеством ДНК, использованным для каждого образца. После добавления субстрата к копируемым образцам измеряли оптическую плотность при 412 нм. Стандартные кривые рассчитывали для всех реакций с серийными разведениями стандарта 8-oxoG для расчета эффективности реакции. Образцы анализировали в трех экземплярах.

статистический анализ

Статистический анализ проводили на основании данных, полученных по меньшей мере из трех независимых экспериментов. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Программа t-критерия Стьюдента в Microsoft Excel использовалась для определения статистической значимости. p <0,05 считалось статистически значимым.

Похожие

Комментарии